Entrega intratecal de um composto de teste ao sistema nervoso central de ratos

Resumo

Fonte: Chen, Y., et al. Entrega intratecal de oligonucleotídeos antisense no sistema nervoso central de ratos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a entrega de um composto de teste no líquido cefalorraquidiano (LCR) por meio de um cateter implantado na coluna vertebral lombar de um modelo de rato. O composto circula ao longo do LCR até o cérebro e a medula espinhal, entra nos neurônios e oferece potencial terapêutico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Cirurgia

1. Com o rato apoiado no tubo cônico de 50 mL, identifique as duas fossetas naturais entre os músculos acima da pelve (setas na Figura 1A). Com uma mão segurando essas fossas, use a outra mão para pressionar suavemente e sentir a coluna da direção caudal para rostral e encontrar o primeiro grande recuo entre as vértebras, e este é o espaço intervertebral entre as vértebras sacrais 1 (S1) e lombares 6 (L6) (Figura 1B).
2. Mova ligeiramente rostralmente para identificar o próximo recuo, o espaço intervertebral entre as vértebras lombares 5 (L5) e L6 e o local da injeção (* na Figura 1A). Use um bisturi para fazer uma incisão de no máximo 2 cm de comprimento na pele ao longo da linha média de rostral a caudal, de modo que o local da injeção fique no centro da incisão (linha pontilhada na Figura 1A).
3. Use uma tesoura de dissecção para dissecar o tecido conjuntivo para visualizar a camada muscular. Em seguida, faça uma incisão de 1 cm na cápsula muscular imediatamente lateral ao processo espinhal dorsal da vértebra lombar L6.
   NOTA: Os ossos da vértebra lombar L6 podem ser visualizados neste ponto.
4. Posicione o conjunto cânula-agulha guia próximo à face anterior da 6ª vértebra lombar e empurre-o para o espaço intervertebral ao longo da face anterior da 6ª vértebra de modo que a extremidade da agulha penetre no canal espinhal. Empurre a cânula guia no lugar ao longo da agulha e remova a agulha 23-G, deixando apenas a cânula guia no lugar.
   NOTA: É útil usar uma pinça romba para localizar o processo dorsal da vértebra lombar L6 antes de inserir a agulha. Geralmente, o líquido cefalorraquidiano (LCR) pode ser visto entrando no cubo da agulha (esse fluido pode ser tingido com um toque de sangue, mas isso não indica que o dano foi causado ou que a agulha não foi colocada corretamente). Os autores não viram uma grande quantidade de sangue ou sangramento grave durante este procedimento. Se ocorrer, um veterinário deve ser contatado para determinar o tratamento apropriado e se os animais devem ser sacrificados.
5. Insira o conjunto cateter-fio na cânula guia. Incline o conjunto cateter-fio para baixo em um ângulo de aproximadamente 45° em relação ao canal espinhal e force a extremidade aproximadamente 0.3 cm no canal espinhal.
6. Remova a cânula guia, deixando o cateter com o fio do estilete no lugar. Remova o fio estilete aproximadamente 2.5 cm da ponta intratecal do cateter e avance o cateter para dentro do canal espinhal até que a marca de 2 cm esteja na entrada do canal (visível abaixo do músculo), conforme mostrado na Figura 2Bvi.
   NOTA: O cateter inserido deve se estender rostralmente para o espaço subaracnóideo. Uma colocação bem-sucedida deve permitir que o cateter se mova livremente nesse espaço.
7. Retire completamente o fio do estilete e o LCR pode ser visto entrando no cateter implantado.
8. Conecte o conjunto do cateter de entrega à extremidade distal do cateter implantado através da extremidade da agulha de 30 G (Figura 2Bv, vi).
9. Coloque 60 μL de solução salina estéril em uma seringa de 100 μL (seringa de lavagem). Carregue um bolus de 30 μL do composto de teste (por exemplo, oligonucleotídeo antisense ou solução ASO) em uma segunda seringa (seringa de injeção).
10. Conecte a seringa de lavagem (carregada com solução salina) à extremidade do adaptador do tubo do conjunto do cateter de entrega (Figura 2Bv). Injete 20 μL de solução salina estéril no espaço intratecal (lavagem pré-injeção).
11. Conecte a seringa de injeção (carregada com composto de teste) à extremidade do adaptador de tubo do conjunto do cateter de entrega (Figura 2Bv). Injete 30 μL de composto de teste no espaço intratecal durante 30 s.
    NOTA: O volume de injeção de rotina de ASO é de 30 μL para obter um bom knockdown na medula espinhal e no córtex. Foi relatado que os volumes de injeção podem afetar a distribuição do composto, embora diferentes volumes de injeção não tenham sido testados. Se outro composto ou volume for usado, a segurança e a eficácia precisam ser determinadas empiricamente.
12. Repita a etapa 1.10 e lave o cateter com mais 40 μL de solução salina estéril (lavagem pós-injeção). Em seguida, retire o conjunto do cateter de entrega do cateter implantado.
    NOTA: Acredita-se que a descarga pré e pós-injeção reduza o sequestro local dos compostos e melhore sua distribuição para as estruturas rostrais.
13. Para cortar assepticamente e selar o cateter implantado, coloque um par de pinças de dissecção estéreis em um esterilizador de esferas até que estejam bem quentes e, em seguida, prenda o tubo com a extremidade quente da pinça.
    NOTA: Esta ação derrete o cateter. Assim, o orifício no tubo desmorona e todos os lados grudam uns nos outros, vedando o tubo de forma asséptica. Em seguida, é colocado no espaço subcutâneo.
14. Use suturas de monofilamento absorvíveis para prender o cateter selado a quente restante ao tecido conjuntivo. Em seguida, use suturas de monofilamento não absorvíveis para fechar a pele sobre o cateter selado a quente seguro.
    NOTA: Os clipes de ferida também podem ser usados conforme aprovado pelo protocolo do comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC). A técnica é compatível com injeções repetidas, embora tenha sido usada apenas para injeções únicas em nossas mãos. A viabilidade de injeções repetidas deve ser avaliada empiricamente com a aprovação do IACUC.
15. Use gaze e soro fisiológico para lavar o sangue da pele e permitir que o animal se recupere da anestesia em uma incubadora aquecida até se mover, momento em que é devolvido à sua gaiola de origem (dois ratos por gaiola).
    NOTA: Ao realizar cirurgias em vários ratos no mesmo dia, limpe as ferramentas com água para remover o sangue e reesterilize usando um esterilizador de esferas secas aquecidas (por pelo menos 20 s, com tempo para esfriar) entre animais. Um novo conjunto de instrumentos é usado para cada 5 animais.
16. Monitore os animais diariamente por pelo menos 3 dias após a cirurgia e continue monitorando-os semanalmente após a cirurgia, de acordo com o protocolo da IACUC.

Resultados

Figura 1: Identificação do local da injeção e da linha de incisão. (A) Com o abdome do rato apoiado por um tubo cônico de 50 mL, as duas fossetas entre os músculos acima da pelve são facilmente vistas (setas). (B) Com uma mão segurando as fossas, use a o...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BD intramedic PE tubing	BD	Polyethylene tubing PE50, diâmetro 0.023 in	BD 427400 (10 ft, Fischer Scientific 22-204008) ou 427401 (100 ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD intramedic PE tubing	BD	Polyethylene tubing PE10, diâmetro 0,011 pol	BD 427410 (10 pés, Fischer Scientific 14-170-11B) ou 4274011 (100 pés, Fischer Scientific 14-170-12B)
Agulhas descartáveis BD PrecisionGlide 30G	BD		BD
Cânula Guia	BD	19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) agulha	BD 305186
Seringa Hamilton 100 ul	Empresa Hamilton	Seringa Hamilton 100 ul
Esterilizador de esferas quentes	Fino		Esterilizador modelo no. FST 250
Povidona scrub	PDI		S48050
Saline	Baxter	Cloreto de sódio 0,9% infusão intravenosa BP 50 ml	FE1306G
Bisturi	Feather	Bisturi descartável	No. 10
Almofada de aquecimento para pequenos animais	K&H Manufacturing		Modelo no. 1060
Fio de estilete	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Campo cirúrgico para toalha	Dynarex		4410
Tesoura cirúrgica e pinça	FST e Fisher Scientific
Suturas	Ethicon		4-0 ou 5-0
Fonte alternativa de materiais pré-fabricados e esterilizados para este procedimento
Cateter dosador sistema	Sistemas de infusão		RIDC-01
Cânula guia	Sistemas de infusão SAI	RIDC-GCA
Cateteres internos		infusão SAI	RIDC-INC
Fio estilete		infusão SAI	RIDC-STY

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