Avaliação do tratamento com plasma à pressão atmosférica em células de neuroblastoma privadas de glicose

Resumo

Fonte: Yan, X., et. al., Nova aplicação de um jato de plasma de pressão atmosférica como agente neuroprotetor contra lesão induzida por privação de glicose de células SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2017)

O vídeo demonstra a atividade neuroprotetora do tratamento com plasma de pressão atmosférica de baixa dose em células de neuroblastoma privadas de glicose, modulando o estresse oxidativo e aumentando a viabilidade celular.

Protocolo

1. Tratamento APPJ (Jato de Plasma de Pressão Atmosférica) de SH-SY5Y

1. Ajuste a distância entre o bico do tubo de quartzo e a plataforma onde a placa de 96 poços será colocada em 3 cm. Certifique-se de que o feixe possa tocar a superfície do meio de cultura.
   NOTA: A distância não é medida a partir do fundo da placa. É primeiro ajustado para 3 cm entre o bico do tubo de quartzo e a plataforma usada para colocar a placa de 96 poços.
2. Antes do tratamento APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet), troque o meio de cultura em cada poço, exceto os poços de controle, para RPMI 1640 sem meio de glicose.
3. Coloque a placa sob o bico APPJ e certifique-se de que os jatos possam disparar verticalmente em cada poço.
4. Trate as células em poços separados com APPJ por 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s e 12 s.
   NOTA: O APPJ é gerado pela ionização do hélio (Figura 1). As células lesadas pela privação de glicose são tratadas por fluxo de hélio de 4 s e 8 s para eliminar os efeitos do hélio nas células. Todos os tratamentos devem ser realizados em triplicata.

2. Ensaio de viabilidade celular

NOTA: Não altere o meio nesta etapa.

1. Após o tratamento com APPJ, incubar as células por 1 h em uma incubadora de células.
2. Adicione 10 μL de solução de Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8) a cada poço.
3. Incubar as células a 37 °C por 4 h.
   NOTA: A linhagem celular SH-SY5Y é sensível a condições de privação de glicose. A viabilidade celular diminui para quase 50% após 1 h de privação de glicose, que é a condição ideal de viabilidade celular para estudos farmacodinâmicos. O CCK-8 não tem citotoxicidade para as células, e as células são incubadas com o reagente CCK-8 por mais 4 h nas condições de privação de glicose após o tratamento com APPJ para verificar a viabilidade celular. Após 8 h de privação de glicose e tratamento com APPJ, o efeito protetor do APPJ foi significativamente reduzido porque a longa duração da privação de glicose levou a danos graves às células SH-SY5Y. Não houve evidência de células vivas após 24 h de privação de glicose.
4. Medir a absorvância a 450 nm com um leitor de microplacas.

Resultados

Figura 1: Reações típicas de RNS (espécies reativas de nitrogênio) e ROS (espécies reativas de oxigênio) nas emissões de APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SH-SY5Y linha celular	China Center for Type Culture Collection	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 medium	Thermo Scientific	21875091	Armazenado a 4 °C
RPMI 1640 meio sem glicose	Thermo Scientific	11879020	Armazenado a 4 °C
Soro fetal de bezerro	Thermo Scientific	16000044	Armazenado a -20 °C
96 poços	placa corning	3599
Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8)	Dojindo	Laboratories CK04	Armazenado a 4 °C
Leitor de microplacas	Tecan	M200 Pro	Para medir a absorbância a 450 nm
Amplificador de Potência de Alta Tensão	Trek	PD06087	Para amplificar a potência
Função Gerador de Sinal	MaZe Electronics Science&Technology	AT30120	Para fornecer o sinal específico
Sonda de Alta Tensão	Tektronix	P6015A	Para detectar alta tensão
Osciloscópio Digital	Tektronix	DPO4104B	Para exibir o sinal