Entrega intranasal de siRNA ao cérebro de camundongo usando um dispositivo de posicionamento

Resumo

Fonte: Ullah, I., et.al. Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega intranasal de siRNA ao sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra uma técnica de administração intranasal precisa para fornecer complexos peptídeo-siRNA direcionados a neurônios ao cérebro de camundongos usando um dispositivo de posicionamento especializado. Os camundongos anestesiados são fixados em uma posição de cabeça para baixo e para frente para otimizar a inalação de siRNA enquanto evita a drenagem pulmonar. O peptídeo alvo facilita a captação mediada por receptores nos neurônios, permitindo a entrega de siRNA direcionado e o silenciamento de genes no cérebro.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Posicionamento do mouse

1. Avalie o nível de anestesia por reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé) para manter o plano cirúrgico.

2. Coloque o dispositivo de posicionamento a uma distância e altura adequadas de modo a fornecer acesso conveniente a todos os reagentes necessários.

3. Uma vez que os ratos estejam devidamente anestesiados, levante suavemente cada rato pela nuca com o polegar e o indicador e coloque-o na cadeira designada.

4. O posicionamento adequado do mouse na cadeira é muito importante nesta fase. Coloque as costas do mouse paralelas ao apoio traseiro da cadeira e a 90° do assento da cadeira. Levante as mãos do mouse e deixe o animal deitar naturalmente na posição de cabeça para baixo e para frente, sem empurrar ou pressionar, conforme mostrado na Figura 1B. Certifique-se de que os membros anteriores do rato fornecem suporte natural enquanto o animal está nesta posição relaxada, sem qualquer desconforto para o rato.

5. Assim que os camundongos estiverem posicionados corretamente, prenda-os com o cinto da cadeira e inicie imediatamente a inoculação intranasal.

2. Entrega intranasal (IN)

NOTA: Este protocolo descreve a entrega IN de complexos RVG9R:siRNA usando o dispositivo de posicionamento do mouse. Usando este protocolo, um máximo de 20-30 μL de solução pode ser facilmente administrado a cada camundongo em gotas de 2 μL. Esse volume é menor que o da cavidade nasal do camundongo, que é de 0,032 cm³, portanto o procedimento não resulta em obstrução letal ou asfixia das narinas. Este protocolo permite a inoculação simultânea de pelo menos quatro camundongos e um máximo de oito camundongos por dispositivo, resultando em otimização de tempo e variabilidade reduzida.

1. Pegue a micropipeta de 10 μL e ajuste-a para 2 μL.

2. Carregue a micropipeta com 2 μL de solução complexa de RVG9R:siRNA (por exemplo, 5,2 μg de siCy5 complexado com 104 μg de RVG9R para o experimento de entrega e 13,5 μg de siSOD1 complexado com 270 μg de RVG9R para o experimento de silenciamento, em um volume final de 25 μL de PBS contendo 5% de glicose.

3. Enquanto segura a pipeta com a mão dominante, ajuste a posição colocando um cotovelo na bancada. Apoie a mão segurando a pipeta com a outra mão para evitar movimentos descontrolados durante a administração.

4. Coloque uma gota de ~2 μL muito perto de uma narina para que o camundongo possa inalar diretamente a gota (consulte a Figura 1B). Se uma pequena gota não for facilmente formada, substitua a ponta da pipeta por uma nova e repita a operação. Use o cronômetro para verificar o intervalo de tempo entre as inoculações.

5. Este dispositivo permite o tratamento de pelo menos quatro camundongos por vez. Se outro grupo de mouses for necessário para repetir a etapa 2.4, defina outra barra com quatro cadeiras acima ou abaixo da primeira barra com quatro cadeiras para acomodar até oito mouses por vez no dispositivo.

6. Repita o passo 2.4 com a outra narina após 3-4 min da primeira inoculação. Este intervalo de tempo é suficiente para o camundongo completar a inalação da primeira dose e restaurar a respiração normal. Se uma gota da solução inalada for desalojada devido a um cheiro acidental da narina do camundongo, reinocular mais 2 μL de solução.

7. Repita todo o processo com narinas alternadas até que a dose de 20-30 μL termine. Levará ~ 30-45 min para concluir todo o procedimento de inoculação.

8. Coloque pomada úmida nos olhos dos camundongos antes de devolvê-los às gaiolas designadas.
NOTA: Não deixe os camundongos sem vigilância até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.

Resultados

Figura 1: Apresentação fotográfica do procedimento de inoculação IN usando o dispositivo de posicionamento. (A) Equipamento experimental necessário para a inoculação IN. B) Animais com a cabeça para baixo e para a frente sentados no dispositivo ...

Materiais

< >< table class='ck-table-resized'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários Cepa de camundongo Balb/cOrient BioN/A6-8 semanas de idade, 20-30gPeptídeos RVG9RPeptronN/AYTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRRRVM9RPeptronN/AMNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRRSoftware, algoritmos e dispositivos Dispositivo de posicionamento do ratoSignet BiotechN/A Oligonucleótidos e primários siSOD1ST PharmN/ASentido: 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1 primersST PharmN / AF: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'