Imagem in vivo das respostas dos neurônios do gânglio geniculado usando microscopia epifluorescente

Resumo

Fonte: Fowler, B. E., et al. Imagem de cálcio in vivo de respostas de neurônios ganglionares geniculados de camundongos a estímulos gustativos. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra um protocolo para administrar saborizantes ao gânglio geniculado exposto cirurgicamente em um camundongo anestesiado e usar fluorescência GCaMP com microscopia epifluorescente para visualizar respostas neuronais em tempo real, auxiliando estudos sobre o processamento do sinal de paladar periférico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Execute o painel de saborizantes
   1. Use a sucção para remover o líquido sobre o geniculado. Opcionalmente, coloque um ponto absorvente para ajudar a mitigar a infiltração e auxiliar na navegação do microscópio.
   2. Coloque o animal em uma almofada absorvente sob o microscópio. Localize o gânglio geniculado: pontos de referência úteis incluem o orifício deixado na bula, o orifício no osso temporal e o sétimo nervo. Usando o filtro FITC / GFP (isotiocianato de fluoresceína / proteína fluorescente verde) no escopo de epifluorescência, verifique se há neurônios ganglionares geniculados que expressam GCaMP individuais. Uma objetiva de 10x (distância de trabalho de 10 mm) fornecerá resolução suficiente para rastrear a atividade de células individuais, mas uma objetiva de 20x (distância de trabalho de 12 mm) também pode ser usada.
   3. Coloque a agulha dispensadora para a linha de saborizante firmemente na boca do animal. Coloque uma placa de Petri abaixo da boca do animal para coletar o fluido.
   4. Certifique-se de que a câmera esteja visualizando o campo de visão do microscópio. Sincronize o início da gravação do vídeo com o início da apresentação do sabor.
   5. Durante a gravação, assista ao feed ao vivo para obter respostas, desvios e infiltrações.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1ml Seringa com trava luer	Fisher Scientific	14-823-30
27 Gauge Agulha de Dispensação Sem Corte	Fisher Scientific	NC1372532
Pontos Absorventes	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfame K	Fisher Scientific	A149025G
BD com agulha permanentemente anexada	Fisher Scientific	14-829-6D
Afastadores sem corte	FST	18200-09
Placa de ensaio	Thor Labs	MB8
de poste de cabeça personalizado	eMachineShop		Veja o arquivo anexo 202410.ems
Poste de cabeça de metal personalizado	eMachineShop		Veja o arquivo anexado 202406.ems
Controlador de temperatura DC	FHC	40-90-8D
Câmera digital, sCMOS OrcaFlash4 Microscópio montado	Hamamatsu	C13440
Disection Scope	Leica	M80
LED Fonte de luz fria	Leica Mcrosystems	KL300LED
Adaptadores de Tubulação Luer Lock 1/16"	Microscópio Fisher	01-000-116
	Olympus	BX51WI
Mini-série Postes Ópticos	Thorlabs	MS2R
Placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875713A
Ar Pressurizado	Airgas	AI Z300
Rotulagem Autoadesiva Fita	Fisher Scientific	159015R
Tubo de Válvula de Aperto de Silicone 1/32" x 1/16" o.d. (por pé)	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Tesoura Fina para Estudantes	Ferramentas de Ciência Fina	91460-11
Sonda Cirúrgica	Roboz Surgical Store	RS-6067
Suporte de Sonda Cirúrgica	Roboz Surgical Store	RS-6061
Dois Estágios	Airgas	Y12FM244B580-AG
	Fisher Scientific	22-046941
Automatismo - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 controlador digital/manual	Automate Sistema	01-18
Valvelink8.2	Automate Scientific	17-pp-54
Xylazine	Anased	NADA# 139-236

Bandejas de alergistas Suporte BD Tubulação Intramédica Regulador de Gás de de Perfusão de Válvula de Aperto Scientific