Liberação de neurotransmissores de imagem usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Implantação de CNiFER no córtex de camundongo

1. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em autoclave antes da cirurgia. Prepare um campo semi-estéril para a cirurgia limpando com etanol 70% e colocando uma fralda de laboratório limpa.
2. Prepare a pipeta de injeção CNiFER puxando um capilar de vidro (diâmetro interno de 0.53 mm) em um extrator de eletrodo vertical. Use um par de pinças de ponta fina nº 5 para quebrar a ponta do eletrodo com um diâmetro de ~ 40 μm.
   Nota: Isso é melhor realizado sob um microscópio de zoom estéreo com uma retícula.
3. Anestesiar um camundongo adulto (dia pós-natal 60-90) C57BL/6 com isoflurano: 4% (v/v) para indução e 1,5 a 2,0% (v/v) para manutenção. Use a pinça da cauda ou do dedo do pé para certificar-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado.
   Nota: Aperte novamente periodicamente e avalie os espasmos do bigode durante a cirurgia para reavaliar a profundidade da anestesia.
4. Cubra os olhos com pomada oftálmica para evitar o ressecamento. Monte o mouse em uma estrutura estereotáxica com barras auriculares. Mantenha a temperatura corporal do rato a 37 °C utilizando uma almofada térmica regulada por uma sonda rectal.
5. Raspe uma área de aproximadamente 5 mm por 12 mm com um barbeador elétrico animal. Aplique Betadine seguido de 70% (v / v) de isopropanol. Use uma lâmina de bisturi para cortar e remover a pele sobre a superfície do crânio. Use uma lâmina de bisturi para remover o periósteo da superfície do crânio. Exponha e limpe a superfície do crânio, conforme descrito para cirurgia estereotáxica.
6. Abaixe uma pipeta de vidro vazia para bregma e registre as coordenadas ântero-posterior (A / P) e médio-lateral (M / L). Referindo-se ao atlas do cérebro do camundongo, calcule a posição do local da injeção. Desloque a pipeta para o local alvo e marque o crânio para posterior formação da janela.
   Nota: O local da injeção e a janela dependem da região a ser estudada e da distribuição das projeções de liberação de neurotransmissores ou peptídeos no córtex. Por exemplo, em uma publicação recente, as coordenadas estereotáxicas +1,0 a +2,0 mm A/P e +1,0 a +2,0 mm M/L foram usadas para injetar células CNiFER no córtex frontal para imagens in vivo da liberação de dopamina durante o condicionamento clássico.
7. Forme uma janela de crânio afinado de 2 mm x 3 mm.
   Nota: O osso na janela deve ter 15-20 μm de espessura. As pequenas manchas brancas no osso não devem ser visíveis quando a superfície do crânio é umedecida, se o osso estiver suficientemente diluído.
8. Coloque uma esponja embebida em líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) na janela para mantê-la úmida enquanto prepara as células para injetar.
9. Colha o clone CNiFER que foi cultivado em um frasco T75 até ~ 80% de confluência. Aspire o meio e lave as células com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Nota: A tripsina é omitida para estas etapas.
10. Remover o PBS e utilizar 10 ml de ACSF para desalojar as células do fundo do balão. Triturar células para dissociar aglomerados de células. Centrifugar e ressuspender o pellet em 100 μl de ACSF. Centrifugue por 30 segundos a 1.400 x g e remova o sobrenadante, deixando um pellet coberto com ACSF. Esta etapa deixa um aglomerado de células em suspensão.
11. Encha a pipeta de injeção preparada na etapa 1.2 com óleo mineral, carregue a pipeta em um nanoinjetor e avance o êmbolo para ejetar um pequeno cordão de óleo. Coloque 5 μl de suspensão de células CNiFER em uma tira de filme plástico de parafina perto da preparação do camundongo. Colocar as células CNiFER ou as células CNiFER de controlo na pipeta puxada.
12. Mova a pipeta para as coordenadas X e Y alvo, ou seja, A/P e M/L anotadas na etapa 1.5. Abaixe a pipeta, perfurando o crânio afinado, e continue a ~ 200-400 μm abaixo da superfície do crânio, para depositar células CNiFER nas camadas 2/3 do córtex.
13. Injete ~ 4,6 nl de células CNiFER no local mais profundo com o nanoinjetor, observe o movimento na interface óleo e celular e aguarde 5 minutos para que as células sejam dispensadas. Retire a pipeta ~100 μm e injete mais ~4,6 nl de células CNiFER, aguarde 5 min. Em seguida, retire a pipeta lenta e suavemente para evitar o refluxo dos CNiFERs. Repita as injeções em um ou mais locais adjacentes.
14. Repita as etapas de injeção 1.8-1.12 com células HEK293 de controle (ou seja, clone HEK293 / TN-XXL / Gqi5 sem receptor acoplado à proteína G [GPCR]). Separe os locais de injeção do CNiFER e da célula de controle em ~ 200 μm.
15. Depois de concluir os implantes celulares, enxágue a janela do crânio afinado com ACSF e espere o crânio secar. Aplique uma gota de cola de cianoacrilato (consulte Materiais) sobre a janela e coloque rapidamente uma tampa de vidro estéril pré-cortada em cima da cola. Empurre suavemente a lamínula contra o crânio por alguns segundos. Deixe a cola secar por 2 min.
16. Sele as bordas da lamínula com cimento dental e forme um poço ao redor da janela para reter a água para a objetiva de imersão.
17. Para imobilizar a cabeça do mouse durante a imagem, prenda uma barra de cabeça personalizada com uma pequena gota de cola de cianoacrilato atrás da janela. Deixe a cola secar completamente e, em seguida, adicione cimento dental adicional para reforçar ainda mais a barra de cabeça personalizada.
18. Cubra o resto da superfície do crânio, exceto a janela, com uma camada de cimento dentário. Certifique-se de que as bordas da pele estejam cobertas por cimento e deixe secar por 20 min.
19. Após a cirurgia, interrompa a administração de isoflurano e deixe o camundongo em uma almofada de aquecimento em uma gaiola até que ele se recupere totalmente da anestesia. Injete 5% (p / v) de glicose em solução salina (subcutânea [s.c.]) para reidratação e 0,05 a 0,1 mg / kg de buprenorfina (intraperitoneal [i.p.], liberação instantânea) para analgesia pós-operatória.
    Nota: Para minimizar a potencial reação imunológica aos CNiFERs humanos, injete o camundongo diariamente com 20 μl / 100 g de ciclosporina (i.p.) começando no dia anterior à injeção de CNiFERs.
20. Retorne o mouse à sua gaiola doméstica para comer e água.

2. Imagem in vivo de clones CNiFER

Nota: A imagem ao vivo é realizada com camundongos usando um microscópio de dois fótons e um aparelho fixo na cabeça. Nenhuma anestesia é necessária durante as sessões de imagem. Ao visualizar animais em estado acordado, limite o apoio de cabeça a apenas algumas horas de cada vez para reduzir os níveis de estresse. Retorne o animal à gaiola de casa entre as sessões de imagem para comida e água. O estresse potencial é minimizado escurecendo as luzes da sala e a parte circundante do mouse em um gabinete.

1. No dia seguinte à cirurgia, monte o mouse em uma plataforma de imagem aparafusando a barra de cabeça de metal implantada no crânio à estrutura de fixação da cabeça.
   Nota: Ao obter imagens de camundongos acordados, a sessão de imagem não deve exceder algumas horas devido ao estresse potencial induzido pelo dispositivo de apoio de cabeça.
2. Coloque a plataforma de imagem com o mouse preso na cabeça em um microscópio de imagem de dois fótons equipado com objetivas de imersão em água de 10X (0.30 NA) e 40X (0.80 NA).
3. Insira um cubo de filtro para imagens de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) (Proteína Fluorescente Ciano Aprimorada [eCFP] e Citrino) que tenha um espelho dicróico a 505 nm e filtros passa-banda que abrangem 460 nm a 500 nm para medir eCFP e 520 nm a 560 nm para medir Citrino.
4. Adicione ACSF ao poço contendo a janela do crânio afinado e abaixe a objetiva de imersão em água no ACSF. Use a ocular em conjunto com uma lâmpada de mercúrio e um cubo de filtro de proteína fluorescente verde (GFP) para localizar a superfície do córtex e da vasculatura abaixo da janela.
   Nota: O padrão da vasculatura ajuda a localizar e obter imagens da mesma região ao longo de dias repetidos de imagens. Mude para a objetiva de imersão em água 40X para localizar CNiFERs focando manualmente na superfície do córtex sobre as células usando o cubo de filtro GFP e uma lâmpada de mercúrio.
5. Configurado para imagens de dois fótons. Selecione o caminho de luz apropriado para imagens de dois fótons. Para um sistema comercial típico, use o software para alternar para o modo de imagem de dois fótons e redirecionar a luz para os tubos fotomultiplicadores (PMTs) nos detectores não digitalizados. Ligue o laser pulsado de femtossegundo infravermelho próximo, selecione um comprimento de onda de 820 nm e uma configuração de potência de 5-15%.
   Nota: 5% de potência normalmente fornece ~ 25 mW na amostra.
6. Defina a tensão PMT1 e PMT2 perto do valor máximo, normalmente 700-1.000 V, dependendo do PMT. Defina o ganho para 1 para cada canal e zere a posição z para a objetiva.
7. Abaixe a objetiva ~ 100 a 200 μm da superfície cortical e inicie a varredura x-y. Ajuste a potência do laser, ganho e tensão PMT para cada canal, ou seja, eCFP e Citrino, para otimizar a relação sinal-ruído da fluorescência CNiFER.
8. Use o recurso de zoom no software para restringir a imagem a uma região que contenha as células CNiFER, bem como uma região de fundo. Use uma taxa de varredura não mais lenta do que um quadro a cada 2 segundos (0,5 Hz) a 4 μs por pixel. Ajuste a média da linha para uma relação sinal-ruído adequada, por exemplo, média de 2 linhas de Kalman.
9. Desenhe uma região de interesse (ROI) ao redor das células CNiFER, cerca de 3 a 4 células por plano. Configure a análise em tempo real das intensidades médias do ROI. Inicie a aquisição para monitorar a fluorescência do CNiFER ao longo do tempo.
10. Colete fluorescência de CNiFERs antes e durante manipulações experimentais, por exemplo, estimulação elétrica, estimulação de Channelrhodopsin-2 (ChR2), comportamento, conforme determinado pelo usuário.
11. Quando o experimento de imagem estiver concluído, retorne o mouse à sua gaiola inicial. Repita a imagem ao longo dos dias, conforme desejado. Ao refazer a imagem, as células referem-se à imagem da vasculatura de baixa ampliação adquirida anteriormente para se orientar de volta para o mesmo campo de imagem (etapa 2.4).
    Nota: Os CNiFERs implantados podem ser visualizados por pelo menos 7 dias.