Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Implantação de CNiFER no córtex de camundongo
- Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em autoclave antes da cirurgia. Prepare um campo semi-estéril para a cirurgia limpando com etanol 70% e colocando uma fralda de laboratório limpa.
- Prepare a pipeta de injeção CNiFER puxando um capilar de vidro (diâmetro interno de 0.53 mm) em um extrator de eletrodo vertical. Use um par de pinças de ponta fina nº 5 para quebrar a ponta do eletrodo com um diâmetro de ~ 40 μm.
Nota: Isso é melhor realizado sob um microscópio de zoom estéreo com uma retícula. - Anestesiar um camundongo adulto (dia pós-natal 60-90) C57BL/6 com isoflurano: 4% (v/v) para indução e 1,5 a 2,0% (v/v) para manutenção. Use a pinça da cauda ou do dedo do pé para certificar-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado.
Nota: Aperte novamente periodicamente e avalie os espasmos do bigode durante a cirurgia para reavaliar a profundidade da anestesia. - Cubra os olhos com pomada oftálmica para evitar o ressecamento. Monte o mouse em uma estrutura estereotáxica com barras auriculares. Mantenha a temperatura corporal do rato a 37 °C utilizando uma almofada térmica regulada por uma sonda rectal.
- Raspe uma área de aproximadamente 5 mm por 12 mm com um barbeador elétrico animal. Aplique Betadine seguido de 70% (v / v) de isopropanol. Use uma lâmina de bisturi para cortar e remover a pele sobre a superfície do crânio. Use uma lâmina de bisturi para remover o periósteo da superfície do crânio. Exponha e limpe a superfície do crânio, conforme descrito para cirurgia estereotáxica.
- Abaixe uma pipeta de vidro vazia para bregma e registre as coordenadas ântero-posterior (A / P) e médio-lateral (M / L). Referindo-se ao atlas do cérebro do camundongo, calcule a posição do local da injeção. Desloque a pipeta para o local alvo e marque o crânio para posterior formação da janela.
Nota: O local da injeção e a janela dependem da região a ser estudada e da distribuição das projeções de liberação de neurotransmissores ou peptídeos no córtex. Por exemplo, em uma publicação recente, as coordenadas estereotáxicas +1,0 a +2,0 mm A/P e +1,0 a +2,0 mm M/L foram usadas para injetar células CNiFER no córtex frontal para imagens in vivo da liberação de dopamina durante o condicionamento clássico. - Forme uma janela de crânio afinado de 2 mm x 3 mm.
Nota: O osso na janela deve ter 15-20 μm de espessura. As pequenas manchas brancas no osso não devem ser visíveis quando a superfície do crânio é umedecida, se o osso estiver suficientemente diluído. - Coloque uma esponja embebida em líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) na janela para mantê-la úmida enquanto prepara as células para injetar.
- Colha o clone CNiFER que foi cultivado em um frasco T75 até ~ 80% de confluência. Aspire o meio e lave as células com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Nota: A tripsina é omitida para estas etapas.
- Remover o PBS e utilizar 10 ml de ACSF para desalojar as células do fundo do balão. Triturar células para dissociar aglomerados de células. Centrifugar e ressuspender o pellet em 100 μl de ACSF. Centrifugue por 30 segundos a 1.400 x g e remova o sobrenadante, deixando um pellet coberto com ACSF. Esta etapa deixa um aglomerado de células em suspensão.
- Encha a pipeta de injeção preparada na etapa 1.2 com óleo mineral, carregue a pipeta em um nanoinjetor e avance o êmbolo para ejetar um pequeno cordão de óleo. Coloque 5 μl de suspensão de células CNiFER em uma tira de filme plástico de parafina perto da preparação do camundongo. Colocar as células CNiFER ou as células CNiFER de controlo na pipeta puxada.
- Mova a pipeta para as coordenadas X e Y alvo, ou seja, A/P e M/L anotadas na etapa 1.5. Abaixe a pipeta, perfurando o crânio afinado, e continue a ~ 200-400 μm abaixo da superfície do crânio, para depositar células CNiFER nas camadas 2/3 do córtex.
- Injete ~ 4,6 nl de células CNiFER no local mais profundo com o nanoinjetor, observe o movimento na interface óleo e celular e aguarde 5 minutos para que as células sejam dispensadas. Retire a pipeta ~100 μm e injete mais ~4,6 nl de células CNiFER, aguarde 5 min. Em seguida, retire a pipeta lenta e suavemente para evitar o refluxo dos CNiFERs. Repita as injeções em um ou mais locais adjacentes.
- Repita as etapas de injeção 1.8-1.12 com células HEK293 de controle (ou seja, clone HEK293 / TN-XXL / Gqi5 sem receptor acoplado à proteína G [GPCR]). Separe os locais de injeção do CNiFER e da célula de controle em ~ 200 μm.
- Depois de concluir os implantes celulares, enxágue a janela do crânio afinado com ACSF e espere o crânio secar. Aplique uma gota de cola de cianoacrilato (consulte Materiais) sobre a janela e coloque rapidamente uma tampa de vidro estéril pré-cortada em cima da cola. Empurre suavemente a lamínula contra o crânio por alguns segundos. Deixe a cola secar por 2 min.
- Sele as bordas da lamínula com cimento dental e forme um poço ao redor da janela para reter a água para a objetiva de imersão.
- Para imobilizar a cabeça do mouse durante a imagem, prenda uma barra de cabeça personalizada com uma pequena gota de cola de cianoacrilato atrás da janela. Deixe a cola secar completamente e, em seguida, adicione cimento dental adicional para reforçar ainda mais a barra de cabeça personalizada.
- Cubra o resto da superfície do crânio, exceto a janela, com uma camada de cimento dentário. Certifique-se de que as bordas da pele estejam cobertas por cimento e deixe secar por 20 min.
- Após a cirurgia, interrompa a administração de isoflurano e deixe o camundongo em uma almofada de aquecimento em uma gaiola até que ele se recupere totalmente da anestesia. Injete 5% (p / v) de glicose em solução salina (subcutânea [s.c.]) para reidratação e 0,05 a 0,1 mg / kg de buprenorfina (intraperitoneal [i.p.], liberação instantânea) para analgesia pós-operatória.
Nota: Para minimizar a potencial reação imunológica aos CNiFERs humanos, injete o camundongo diariamente com 20 μl / 100 g de ciclosporina (i.p.) começando no dia anterior à injeção de CNiFERs. - Retorne o mouse à sua gaiola doméstica para comer e água.
2. Imagem in vivo de clones CNiFER
Nota: A imagem ao vivo é realizada com camundongos usando um microscópio de dois fótons e um aparelho fixo na cabeça. Nenhuma anestesia é necessária durante as sessões de imagem. Ao visualizar animais em estado acordado, limite o apoio de cabeça a apenas algumas horas de cada vez para reduzir os níveis de estresse. Retorne o animal à gaiola de casa entre as sessões de imagem para comida e água. O estresse potencial é minimizado escurecendo as luzes da sala e a parte circundante do mouse em um gabinete.
- No dia seguinte à cirurgia, monte o mouse em uma plataforma de imagem aparafusando a barra de cabeça de metal implantada no crânio à estrutura de fixação da cabeça.
Nota: Ao obter imagens de camundongos acordados, a sessão de imagem não deve exceder algumas horas devido ao estresse potencial induzido pelo dispositivo de apoio de cabeça. - Coloque a plataforma de imagem com o mouse preso na cabeça em um microscópio de imagem de dois fótons equipado com objetivas de imersão em água de 10X (0.30 NA) e 40X (0.80 NA).
- Insira um cubo de filtro para imagens de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) (Proteína Fluorescente Ciano Aprimorada [eCFP] e Citrino) que tenha um espelho dicróico a 505 nm e filtros passa-banda que abrangem 460 nm a 500 nm para medir eCFP e 520 nm a 560 nm para medir Citrino.
- Adicione ACSF ao poço contendo a janela do crânio afinado e abaixe a objetiva de imersão em água no ACSF. Use a ocular em conjunto com uma lâmpada de mercúrio e um cubo de filtro de proteína fluorescente verde (GFP) para localizar a superfície do córtex e da vasculatura abaixo da janela.
Nota: O padrão da vasculatura ajuda a localizar e obter imagens da mesma região ao longo de dias repetidos de imagens. Mude para a objetiva de imersão em água 40X para localizar CNiFERs focando manualmente na superfície do córtex sobre as células usando o cubo de filtro GFP e uma lâmpada de mercúrio. - Configurado para imagens de dois fótons. Selecione o caminho de luz apropriado para imagens de dois fótons. Para um sistema comercial típico, use o software para alternar para o modo de imagem de dois fótons e redirecionar a luz para os tubos fotomultiplicadores (PMTs) nos detectores não digitalizados. Ligue o laser pulsado de femtossegundo infravermelho próximo, selecione um comprimento de onda de 820 nm e uma configuração de potência de 5-15%.
Nota: 5% de potência normalmente fornece ~ 25 mW na amostra. - Defina a tensão PMT1 e PMT2 perto do valor máximo, normalmente 700-1.000 V, dependendo do PMT. Defina o ganho para 1 para cada canal e zere a posição z para a objetiva.
- Abaixe a objetiva ~ 100 a 200 μm da superfície cortical e inicie a varredura x-y. Ajuste a potência do laser, ganho e tensão PMT para cada canal, ou seja, eCFP e Citrino, para otimizar a relação sinal-ruído da fluorescência CNiFER.
- Use o recurso de zoom no software para restringir a imagem a uma região que contenha as células CNiFER, bem como uma região de fundo. Use uma taxa de varredura não mais lenta do que um quadro a cada 2 segundos (0,5 Hz) a 4 μs por pixel. Ajuste a média da linha para uma relação sinal-ruído adequada, por exemplo, média de 2 linhas de Kalman.
- Desenhe uma região de interesse (ROI) ao redor das células CNiFER, cerca de 3 a 4 células por plano. Configure a análise em tempo real das intensidades médias do ROI. Inicie a aquisição para monitorar a fluorescência do CNiFER ao longo do tempo.
- Colete fluorescência de CNiFERs antes e durante manipulações experimentais, por exemplo, estimulação elétrica, estimulação de Channelrhodopsin-2 (ChR2), comportamento, conforme determinado pelo usuário.
- Quando o experimento de imagem estiver concluído, retorne o mouse à sua gaiola inicial. Repita a imagem ao longo dos dias, conforme desejado. Ao refazer a imagem, as células referem-se à imagem da vasculatura de baixa ampliação adquirida anteriormente para se orientar de volta para o mesmo campo de imagem (etapa 2.4).
Nota: Os CNiFERs implantados podem ser visualizados por pelo menos 7 dias.