Isolamento e purificação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina recombinante

Resumo

Fonte: Jain, R. W., et al. Produção e purificação simples e eficientes de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo para estudos experimentais de encefalomielite autoimune. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o isolamento e purificação do MOGtag, uma glicoproteína recombinante de oligodendrócitos de mielina (MOG) usada em estudos de encefalomielite autoimune experimental (EAE). O protocolo envolve lise bacteriana, sonicação, centrifugação e cromatografia de afinidade de níquel para obter MOGtag purificado. Essa proteína permite a pesquisa de autoimunidade mediada por células B em modelos de esclerose múltipla.

Protocolo

1. Colheita da proteína MOGtag

NOTA: Nesta fase, a bactéria terá produzido grandes quantidades de proteína MOGtag. Para colher MOGtag, as bactérias são primeiro lisadas em um tampão Triton X-100, seguido de sonicação. O MOGtag é então liberado dos corpos de inclusão e desnaturado com imidazol e guanidina, resultando em uma solução de proteína bruta contendo a proteína MOGtag.

1. Retirar uma alíquota de 1 ml de uma das culturas durante a noite e transferi-la para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pulverize as células a 16.000 x g por 1 min e remova o sobrenadante. Rotule o tubo TO/N (pós-indução) e, em seguida, coloque o pellet bacteriano em um freezer de -20 °C para futura análise da página SDS (Figura 2).
2. Distribuir as culturas uniformemente por frascos de 250 ml compatíveis com centrifugação de alta velocidade e mantê-los no gelo a partir deste ponto. Pulverize as células bacterianas a 22.000 x g por 15 min a 4 ° C.
3. Descarte o sobrenadante. Conservar os grânulos bacterianos a -20 °C ou continuar no passo 1.4.
4. Prepare o tampão de lise (0,1 mg / ml de lisozima de ovo de galinha, 0,1% de Triton-X (v / v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) adicionando 60 μl de Triton X-100 e 120 μl de 50 mg / ml de solução estoque de lisozima de ovo de galinha a 60 mL de PBS.
5. Ressuspenda e combine todos os pellets bacterianos da etapa 1.3 em um total de 30 ml de tampão de lise. Transferir este volume para um tubo de 50 ml de fundo redondo capaz de centrifugação a alta velocidade. Coloque este tubo em banho-maria a 30 °C por 30 min. Durante o tempo de incubação, agite o tubo duas vezes para ressuspender as células.
6. Após a incubação, transferir o tubo para o gelo e sonicar a solução a 20 kHz, amplitude de 70%, pulsar por 3 segundos, pulsar por 3 segundos e cinco pulsos por rodada. Sonicar a solução durante seis voltas no total e deixar a solução arrefecer no gelo entre as voltas.
7. Centrifugue a solução a 24.000 x g durante 15 min a 4 °C. Elimine o sobrenadante e repita os passos 1,5-1,7 uma vez. Armazene o pellet a -20 °C ou continue na etapa 1.8.
8. Preparar o tampão A (500 mM de NaCl (cloreto de sódio), 20 mM de Tris-HCl (cloridrato de Tris (hidroximetil)aminometano), 5 mM de imidazol, pH 7,9) adicionando 0,8766 g de NaCl, 0,09456 g de Tris-HCl e 0,01021 g de imidazol a um copo de 100 ml. Adicionar água até o volume atingir 28 ml e, em seguida, ajustar o pH da solução para 7,9. Em seguida, transferir a solução para uma garrafa graduada de 100 ml e adicionar água até o volume atingir 30 ml.
9. Ressuspender o sedimento do passo 1.7 em 30 ml de tampão A e incubar esta solução a 4 °C durante 3 horas. Durante este tempo, pesar 17,2 g de guanidina-HCl.
10. Sonicar a solução no gelo utilizando as mesmas definições do passo 1.6. Em seguida, adicione 17,2 g de guanidina-HCl à solução. Incube no gelo por 1 hora para solubilizar a proteína MOGtag.
11. Centrifugue a solução a 24.000 x g durante 30 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante e conservá-lo a 4 °C até à purificação das proteínas.

2. Purificação de proteínas

NOTA: Nas etapas a seguir, a proteína MOGtag será purificada por meio de 4 rodadas de absorção em resina de níquel carregada (via His-tag) e eluição.

1. Faça os seguintes tampões:
   1. prepare o tampão B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidina-HCl, pH 7,9). Adicionar 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 0,0681 g de imidazol e 114,64 g de guanidina-HCl a um copo de 500 ml. Em seguida, adicione água até atingir 190 ml e ajuste o pH para 7,9. Transferir a solução para um cilindro graduado de 250 ml e adicionar água até o volume atingir 200 ml.
   2. Prepare o tampão de eluição (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 0,5 M de imidazol, 6 M de guanidina-HCl, pH 7,9). Adicione 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 6,808 g de imidazol e 114,64 g de guanidina-HCl a um béquer de 500 mL. Adicione água até atingir 190 ml e ajuste o pH para 7,9. Transferir a solução para um cilindro graduado de 250 ml e adicionar água até o volume atingir 200 ml.
   3. Prepare o tampão de tira (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), pH 7,9). Adicionar 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 40 ml de EDTA a 500 mM a um copo de 500 ml. Adicione água até atingir 190 mL e ajuste o pH para 7,9. Transferir a solução para um cilindro graduado de 250 ml e adicionar água até o volume atingir 200 ml.
   4. Prepare o tampão de carga (sulfato de níquel 0.1 M). Adicione 5,257 g de sulfato de níquel a um copo de 500 ml e adicione água até atingir 190 ml (CUIDADO, não manuseie o sulfato de níquel fora de uma capela até que o sulfato de níquel tenha sido dissolvido em água). Uma vez dissolvido o sulfato de níquel, transferir a solução para uma proveta graduada de 250 ml e adicionar água até o volume atingir 200 ml.
2. Dividir 10 ml de resina de níquel entre dois tubos de centrífuga cônicos de 50 ml, capazes de suportar forças centrífugas superiores a 4.500 x g (5 ml em cada tubo).
3. Carregue e equilibre a resina de níquel:
   1. Lave a resina adicionando 40 ml de água a cada tubo que contém a resina. Coloque os tubos horizontalmente em um balancim e deixe-os agitar por 5 min a 4 °C. Uma vez terminado, centrifugue os tubos a 4.500 x g por 8 min a 4 °C.
   2. Rejeitar o sobrenadante pipetando para evitar perturbar o pellet. Adicione 40 ml de tampão de carga a cada tubo. Transfira os tubos para um balancim e deixe-os agitar por 15 min a 4 °C. Uma vez terminado, centrifugue os tubos a 4.500 x g por 8 min a 4 °C.
   3. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 40 ml de tampão B aos tubos. Transfira os tubos para um balancim e deixe-os agitar por 5 min a 4 °C. Uma vez terminado, centrifugue os tubos a 4.500 x g por 8 min a 4 ° C e, em seguida, descarte os sobrenadantes.
4. Opcional: Pegue 150 μl da proteína solubilizada coletada na etapa 1.11 e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Rotule o tubo como pré-incubação e congele-o a -20 ° C para futura análise de página de SDS (dodecil sulfato de sódio) (Figura 2, MOGtag bruto).
5. Purifique a MOGtag Protein:
   1. Transfira todo o volume de proteína solubilizada da etapa 1.11 (~40 ml, menos a pequena amostra removida na etapa 2.4) para o primeiro tubo (Figura 1, tubo 1) contendo resina de níquel da etapa 2.3, misture e coloque horizontalmente em um balancim a 4 °C por 1 hora.
   2. Centrifugue o tubo a 4.500 x g por 8 min a 4 °C. Uma vez terminado, transfira o sobrenadante para o segundo tubo (Figura 1, tubo 2) de resina de níquel e incube conforme descrito na etapa anterior. Enquanto isso, continue com as etapas 3 a 6 abaixo com o tubo 1.
   3. Ressuspender a resina de níquel no tubo 1 em 40 ml de tampão de eluição e colocar o tubo horizontalmente num balancim a 4 °C durante 5 min. Em seguida, centrifugue o tubo a 4.500 x g por 8 min a 4 °C.
   4. Transferir o sobrenadante contendo proteína MOGtag eluída para um frasco de 250 ml rotulado como «proteína MOGtag purificada» e manter este frasco a 4 °C. A cada etapa de eluição, agrupe o sobrenadante resultante neste frasco.
   5. Adicionar 40 ml de tampão à resina de níquel e colocar horizontalmente sobre um balancim durante 5 min a 4 °C.
   6. Centrifugue o tubo a 4.500 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e recarregue a resina de níquel conforme listado na etapa 2.3.
   7. Quando terminar, avance com o segundo tubo conforme listado na etapa 2.5. Um total de 4 rodadas de absorção da proteína solubilizada da etapa 1.11 na resina de níquel carregada e eluição recuperará a maior parte da proteína, embora, se desejado, proteína adicional possa ser recuperada em rodadas adicionais de absorção e eluição.
6. Quando quatro (ou mais) rodadas de absorção e eluição estiverem completas, armazene a proteína purificada combinada a 4 ° C durante a noite. A resina de níquel pode ser armazenada em 40 ml de uma solução de etanol a 20% a 4 °C até que seja novamente necessária.

Resultados

Figura 1: Visão geral das etapas necessárias para produzir proteína MOGtag pura. Para gerar a proteína MOGtag, as bactérias que expressam a proteína MOGtag são cultivadas em altas densidades e, em seguida, induzidas a express...

Materiais

< >< table class='ck-table-resized'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários BL21 E.coli-pet32-MOGtagKerfoot lab Essas bactérias são necessárias para produzir a proteína MOGtag. Os estoques de glicerol dessas bactérias estão disponíveis mediante solicitação.Moleiro de caldo LBBioshopLBL407.1 AmpicilinaBio basicAB0028Reconhecer o pó em 50% de etanol / 50% de H₂O a 100 mg / ml. Armazenar a -20 °C.IPTGBioshopIPT002.5Reconhecer o pó em H₂O a 1M e armazenar a -20 °C.Lisozima de ovo de galinhaBioshopLYS702.10Reconstituir em H₂O a 50 mg/ml e armazenar a -80 °C.Triton-X100SigmaT-8532 Solução salina tamponada com fosfatoLife technologies20012-027Solução salina tamponada com fosfato comercial não é necessária, qualquer solução salina tamponada com fosfato padrão feita em laboratório é suficiente.Cloreto de sódioBioshopSOD004.1 Tris-HClBioshopTRS002.1 ImidazolBioshopIMD508.100 Guanidina-HClSigmaG3272A qualidade deve ser superior a 98% de pureza.0,5M EDTAbioshopEDT111.500 Sulfato de níquel (II)BioshopNIC700.500 Sua resina de ligaçãoEMD Millipore69670-3Armazenar em etanol a 20% 80% H₂O a 4 °CEtanol anidroÁlcoois comerciaisP016EAANDiluir com água conforme necessário.Ácido acético glacialBioshopACE222.1 Acetato de sódio trihidratadoBioshopSAA305.500 Albumina de soro bovino padrãobio-rad500-0206 Ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico di-hidratadoFisher scientificBP120-500 Polietilenoglicol 3350BioshopPEG335.1 polietilenoglicol 8000BioshopPEG800.1 SonicatorFisher scientificFB-120-110 Sulfato de dodecil de sódioBioshopSDS001