Regulando o crescimento de células de Schwann in vitro usando a técnica de campo elétrico pulsado de nanossegundos

Resumo

Fonte: Han, J., et.al. Regulando o crescimento da célula de Schwann por campo elétrico pulsado de nanossegundos para regeneração nervosa periférica in vitro. J. Vis. Exp. (2024)

Este vídeo demonstra a aplicação da técnica de campo elétrico pulsado de nanossegundos (nsPEF) para modular o crescimento da célula de Schwann (SC). Os pulsos elétricos rápidos induzem nanoporos transitórios nas membranas SC, facilitando o influxo de cálcio que ativa as vias de sinalização que conduzem a proliferação, desdiferenciação e secreção de fatores neurotróficos de SC. Essas respostas celulares aumentam o suporte axonal, a sobrevivência neuronal e a potencial mielinização, destacando o nsPEF como uma ferramenta promissora para o reparo do nervo.

Protocolo

1. Descongelamento de células RSC96 criopreservadas

1. Descongele o criovial contendo 1 mL de suspensão celular agitando-o rapidamente em banho-maria a 37 ° C e, em seguida, adicione-o a um tubo de centrífuga contendo 4-6 mL de meio de cultura completo e misture bem.
2. Centrifugue a 1000 x g durante 3-5 min, elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 ml de meio de cultura completo.
3. Adicionar a suspensão celular a um balão de cultura (ou cápsula) contendo 6-8 ml de meio de cultura completo e incubar a 37 °C durante a noite.
4. No dia seguinte, observe o crescimento e a densidade celular ao microscópio.

2. Passagem celular:

NOTA: Se a densidade celular atingir 80% -90%, ela está pronta para passagem.

1. Descarte o meio de cultura e enxágue as células 1-2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem íons de cálcio e magnésio.
2. Adicionar 0,25% (p/v) de tripsina-0,53 mM de EDTA ao balão de cultura (1-2 ml para um balão T25, 2-3 ml para um balão T75) e incubar a 37 °C durante 1-2 min.
3. Observe o descolamento da célula ao microscópio. Se a maioria das células se tornar redonda e se desprender, retorne rapidamente o frasco para a área de trabalho, bata suavemente no frasco e adicione 3-4 mL de meio de cultura contendo 10% de FBS para interromper a digestão.
4. Misture o conteúdo, aspire a solução e centrifugue a 1000 x g por 5 min. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células adicionando 1-2 mL de meio de cultura fresco e pipetando suavemente.
5. Transferir a suspensão celular para um novo balão T25 na proporção de 1:2 e adicionar 7 ml de meio de cultura.

3. Operação do dispositivo nsPEF

1. Ressuspenda as células RSC96 em 1 mL de meio de cultura DMEM e transfira-as para placas colorimétricas com eletrodos em ambos os lados.
2. Ligue o interruptor de alimentação.
3. Ajuste os parâmetros girando o botão no instrumento para alterar a intensidade do campo elétrico. As intensidades estabelecidas neste estudo são 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm e 40 kV/cm.
4. Gire cuidadosamente os eletrodos até que apareçam faíscas, permitindo que as células recebam 5 pulsos de nsPEF de acordo com as intensidades de intensidade de campo predefinidas antes de separar imediatamente os dois eletrodos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fonte de alimentação de alta tensão para nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Pipeta	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
RSC96 Schwann células	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Cabo especial para nsPEF	Times Microwave Systems	M17 / 78-RG217