Uma injeção de vetor viral na medula espinhal de rato para rastreamento neuronal retrógrado

Resumo

Fonte: Keefe, K. M., et al. A injeção direta de um vetor lentiviral destaca várias vias motoras na medula espinhal do rato. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a injeção de um vetor viral de transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) na medula espinhal de ratos para rastrear as vias neuronais. O vírus possui glicoproteínas para entrada sináptica e um gene codificador de proteína fluorescente. A agulha é inserida na medula espinhal e a suspensão do vírus é administrada a uma taxa controlada. A agulha é finalmente retirada após tempo suficiente para a difusão viral.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparações pré-cirúrgicas

1. Prepare agulhas de vidro puxadas para injeção viral alguns dias antes da cirurgia usando pipetas capilares de vidro de 3,5 nanolitros projetadas para injetores de nanolitros. Puxe cada pipeta em um extrator de agulhas de duas etapas de acordo com as instruções do fabricante para criar modelos de duas agulhas.
2. Refine a ponta dos modelos de agulha cortando aproximadamente 1-2 mm de excesso de vidro com uma microtesoura. Meça o tamanho aproximado da abertura sob um microscópio com uma lâmina de calibração de microscópio para isolar agulhas com aberturas de 30-40 μm.
3. Com a agulha posicionada a 30°, use um chanfrador de micropipeta para criar uma ponta com uma abertura de 30-40 μm e um ângulo chanfrado de 45°. Verifique a largura da abertura usando a escala Vernier no slide de calibração. Passe água e etanol pela agulha de vidro usando uma seringa com um acessório de agulha flexível para lavar os detritos e marque a agulha em intervalos regulares com um marcador preto.
4. Coloque as agulhas em uma placa de Petri coberta previamente limpa com etanol 70% e esterilize por 30 min em uma capela de biossegurança sob luz ultravioleta ou UV.
5. Prepare o lentivírus de transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) removendo um volume adequado do freezer imediatamente antes do procedimento.
   NOTA: Um volume adequado inclui a quantidade necessária para a injeção (1 μL por injeção x número de injeções) mais uma pequena quantidade de volume extra para contabilizar as perdas de pipetagem e carga. Transporte e armazene o vírus no gelo quando não estiver em uso.
6. Prepare o injetor conectando-o à microbomba e colocando-o em um micromanipulador com escala Vernier.
7. Para preparar a agulha de vidro, carregue cuidadosamente um corante colorido, como óleo vermelho, com uma seringa equipada com uma agulha flexível. Certifique-se de que não restam bolhas na agulha. Use uma técnica asséptica ao manusear a agulha e evite tocar na ponta.
8. Insira a agulha de vidro no injetor, certificando-se de que a agulha esteja encaixada corretamente nas arruelas, a tampa do injetor esteja bem aparafusada e a agulha do injetor de aço seja estendida aproximadamente 3/4 do comprimento da agulha de vidro. Os vírus podem ser carregados na agulha em uma etapa posterior.

2. Anestesia e preparação do local cirúrgico

1. Pese o animal em uma balança digital. Registre o peso pré-operatório para determinar o volume de anestésico necessário e permitir o monitoramento do peso pós-operatório. Ratos Sprague-Dawley fêmeas, aproximadamente 200–250 g, foram usados neste protocolo.
2. Anestesiar o rato usando inalação de isoflurano ou uma solução injetada de cetamina / xilazina (k / x). Aqui, a cetamina é injetada por via intraperitoneal na dose de 67 mg/kg e a xilazina na dose de 6,7 mg/kg.
3. Confirme um plano anestésico apropriado beliscando o pé com firmeza. Se ocorrer abstinência reflexiva, aguarde alguns minutos adicionais antes de prosseguir.
   NOTA: Observe também os bigodes, olhos e frequência respiratória em busca de sinais de consciência. Se os bigodes estiverem se contraindo, o olho piscar quando tocado suavemente ou a respiração for rápida e superficial, espere até que o plano anestésico esteja mais profundo para prosseguir com o protocolo. Além disso, monitore esses sinais durante a laminectomia e a cirurgia de injeção. Se o animal apresentar um plano anestésico raso, administre uma injeção de reforço apenas de cetamina igual a 1/2 da dosagem original de k / x.
4. Raspe o rato ao longo da linha média dorsal dos quadris até o ângulo inferior das escápulas. Puxe a pele do animal esticada para um barbear mais fácil e preciso.
5. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos.
6. Aplique um anti-séptico na área raspada para esterilizar o local. Para a primeira esfoliação, molhe a gaze estéril com uma solução de iodo a 5% e limpe todos os cabelos e detritos. Em seguida, passe um golpe unidirecional com gaze estéril embebida em etanol 70% para que nenhuma área seja contatada duas vezes. Use essa mesma técnica alternando gaze embebida em iodo e etanol mais duas vezes.

3. Campo cirúrgico e preparação

1. do instrumento Prepare um conjunto de ferramentas cirúrgicas autoclavadas que incluem bisturi, rongeurs, pinça de dente de rato, tesoura de mola, hemostáticos, pinça curva de ponta média e afastadores ou ganchos pesados, desembrulhando o envoltório estéril para criar um campo estéril.
2. Abra um pacote de luvas cirúrgicas estéreis e coloque o envoltório de luvas estéril sobre a mesa. Use-o como um campo estéril adicional para ferramentas usadas para evitar a contaminação do invólucro estéril.
3. Solte uma lâmina de bisturi # 10 no campo estéril. Prenda a lâmina a um cabo com hemostáticos. Posicione solução salina estéril, sutura de categute crômico 4.0 e materiais para controlar o sangramento, como cauterizador, gaze estéril, aplicadores estéreis com ponta de algodão (para sangramentos musculares) ou gelfoam ou cera de osso (para sangramentos ósseos) em um local acessível.
4. Recupere o animal e coloque-o em um pano estéril. Coloque gaze embaixo da bexiga para coletar a urina. Apoie a área-alvo com uma toalha enrolada sob o abdômen. Se disponível, coloque uma almofada de aquecimento cirúrgica embaixo do pano estéril, especialmente para procedimentos mais longos.
   NOTA: A esterilidade é importante durante a cirurgia de sobrevivência. Mantenha um borrifador de etanol a 70% à mão para manter a esterilidade das mãos enluvadas e use um esterilizador de esferas se a esterilidade do instrumento estiver comprometida ou entre cirurgias individuais.

4. Expondo a coluna vertebral e identificando o local da laminectomia

1. Identifique a área onde será feita uma incisão na pele pressionando os dedos suavemente na última costela para localizar a vértebra Lumber ou L1. Usando isso como um ponto de referência, faça uma incisão na pele de 3-4 cm com um bisturi cirúrgico # 10 terminando logo abaixo de L1 para expor o músculo. Segure a pele esticada espalhando suavemente e pressionando firmemente com a lâmina do bisturi para garantir uma incisão limpa.
2. Corte e espalhe a gordura superficial com pinças e tesouras, se necessário. (Dependendo da vértebra alvo, pode ou não haver uma grande almofada de gordura superficial ao músculo.)
3. Sinta os processos espinhosos com a lâmina plana do bisturi ou um dedo. Freqüentemente, a área da linha média será delineada por um "V" de fáscia branca em ambos os lados. Faça um pequeno corte rostral para permitir espaço para agarrar com segurança um processo superior com uma pinça de dente de rato e, em seguida, faça dois cortes longos e profundos o mais próximo possível dos processos. No ponto mais profundo do corte, a superfície dorsal das vértebras pode ser sentida com a lâmina do bisturi.
4. Segure os músculos laterais de lado com afastadores ou ganchos pesados para melhorar a visibilidade. Limpe os músculos ao redor dos processos com um bisturi, tesoura de mola ou rongeurs para determinar o formato de suas cabeças.
   NOTA: Lembre-se de que a medula espinhal não se estende por todo o comprimento da coluna vertebral, pois o tecido da medula espinhal para de crescer mais cedo do que o osso. Isso significa que o nível da coluna vertebral alvo pode estar abaixo de uma vértebra com nome diferente.
5. Localize o tórax ou T11 e os processos T12 e T13 adjacentes.
   NOTA: A assistência no direcionamento dos níveis vertebrais corretos pode ser encontrada em um atlas da medula espinhal de ratos e estudos anteriores delineando pontos de referência no camundongo, que tem uma estrutura vertebral muito semelhante6,33. Deixe um processo espinhoso rostral, como T9, intacto para dar um ponto de referência da linha média.

5. Realização de uma laminectomia

1. Uma vez identificada corretamente a área-alvo, realize laminectomias dos aspectos dorsais de T11-T13. Espalhe suavemente as vértebras para revelar os ligamentos intervertebrais, que são bons locais para inserir rongeurs para a mordida inicial do osso. Segure os rongeurs em uma posição semifechada para aumentar o controle fino.
2. Remova os processos espinhosos e o aspecto dorsal das vértebras dando pequenas mordidas com os rongeurs. Tenha cuidado para não danificar a medula espinhal ou perturbar a dura-máter. Levante ligeiramente com a pinça de dente de rato para ajudar a afastar a medula espinhal das vértebras e diminuir a tendência de atingir o tecido da medula espinhal.
3. Afaste o osso da linha média para que o vaso sanguíneo da linha média possa ser observado. Deixe uma janela que mostre claramente o tecido da medula espinhal e esteja livre de detritos.
4. Toque suavemente a medula espinhal com uma pinça. Alguns animais podem pular reflexivamente, mesmo que seu plano anestésico seja profundo. Aplique algumas gotas de um agente anestésico, como a lidocaína, diretamente na medula espinhal para evitar saltos durante o procedimento de injeção.
5. Prenda o animal em um suporte espinhal prendendo uma pinça estabilizadora aos processos espinhosos rostral e caudal à janela de laminectomia. Levante o abdômen do animal usando o suporte espinhal para anular o efeito dos movimentos respiratórios. Isso aumentará a estabilidade da agulha e garantirá a profundidade apropriada de injeção.

6. Carregando o vírus e posicionando o injetor

1. Carregue o vírus no injetor pipetando aproximadamente 5 μL em um pedaço de parafilme e posicionando a agulha de forma que a ponta fique dentro da gota.
2. Use a microbomba para retirar até 4 μL de vírus a uma taxa de 20–100 nL/s.
3. Configure o controlador para injetar e liberar uma pequena quantidade de vírus da agulha para garantir que a ponta da agulha não esteja bloqueada. Limpe o excesso de vírus com um lenço umedecido.
   NOTA: Uma seringa Hamilton com agulha de aço pode ser usada como alternativa às pipetas de vidro puxado.
4. Posicione o micromanipulador de forma que a escala Vernier fique visível e posicione a agulha na linha média da medula espinhal.
   NOTA: A linha média às vezes pode ser localizada por um grande vaso sanguíneo que corre na superfície anterior da medula espinhal. No entanto, isso pode variar em ratos individuais, e o direcionamento da linha média deve ser confirmado por comparação com um processo espinhoso intacto.
5. Direcione a agulha lateralmente em 0,8 mm usando a escala Vernier no micromanipulador.
6. Abaixe a agulha até a medula espinhal até que ela recue, mas não perfure, a dura-máter. Usando um movimento rápido de torção, perfure a dura-máter com a agulha até que ela afunde a uma profundidade de 1,5 mm.

7. Injetando o vírus na medula espinhal

1. Assim que a agulha estiver no lugar, programe o injetor para injetar a uma taxa de 400 nL / min. Confirme se o vírus está entrando na medula espinhal observando o progresso da frente do corante. Não deve haver vazamento óbvio ou abaulamento do tecido da medula espinhal. Se for observado vazamento, isso às vezes pode ser aliviado reduzindo a velocidade de injeção para 200 nL/min.
2. Assim que a injeção terminar, deixe a agulha descansar na medula espinhal por 2 a 5 minutos (dependendo do volume injetado) para facilitar a difusão do vírus.
3. Retire lentamente a agulha e passe para o próximo local de injeção. Injete 1 μL de vírus em cada um dos 6 locais uniformemente espaçados a aproximadamente 1 mm de distância ao longo do comprimento do tecido espinhal L1-L4. A mesma agulha pode ser usada para cada injeção, desde que continue a funcionar corretamente.

8. Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios

1. Retire o animal do suporte espinhal e retire afastadores ou ganchos usados para espalhar o músculo lateral. Certifique-se de que a ferida esteja livre de todos os detritos antes de fechar.
2. Suturar o músculo usando uma sutura de categute crômico 4.0. Corte os fios de sutura próximos ao nó para reduzir a probabilidade de irritação interna da pele.
3. Grampeie a pele fechada usando clipes de 9 mm. Para permitir uma cicatrização ideal, alinhe as bordas da pele antes de grampear.
4. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento de convecção de água e monitore até acordar.
5. Injete 5 a 10 mL de solução salina estéril por via subcutânea para repor líquidos e um antibiótico como cefazolina para prevenir infecções. Quando o animal estiver ambulatório, coloque-o de volta em sua gaiola de origem e forneça analgésicos iniciais. Monitore os ratos quanto a qualquer sinal de dor e angústia e trate de acordo com o procedimento aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) para alívio da dor.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#10 Lâminas de bisturi	Roboz	RS-9801-10	Para uso com o bisturi.
Seringas de 1 mL	Becton, Dickinson and Company	309659	Para injeção de IP anestésico, possíveis doses de reforço anestésico e injeções de antibióticos.
Seringas de 10mL	Becton, Dickinson and Company	309604	Para injetar solução salina no animal, pós-cirurgia.
4.0 Sutura de categute crômica	DemeTECH	NN374-16	Para religar o músculo durante o fechamento.
48000 Micropipeta Beveler	World Precision Instruments	32416	Usado para chanfrar as pontas dos tubos capilares de vidro puxados para formar agulhas de vidro funcionais.
Solução de Iodo a 5%	Purdue Products L.P.	L01020-08	Para uso na esterilização do local cirúrgico.
70% Etanol	N/A	N/A	Para esterilização de agulhas de vidro recém-preparadas, modelos animais durante a preparação cirúrgica e mãos do cirurgião durante a cirurgia, bem como todas as outras pequenas manutenções de esterilidade.
Anestésico (Solução de Cetamina/Xilazina)	Zoetis	240048	Para manter o animal no plano correto de consciência durante a cirurgia.
Antibiótico (cefazolina)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Para ser injetado por via subcutânea para prevenir infecções pós-cirúrgicas.
Esterilizador de esferas	CellPoint	5-1450	Para esterilizar instrumentos cirúrgicos por calor.
Ferramentas de	Ciência Fina	19009-00	Para selar o osso em caso de sangramento ósseo.
Ferramentas Cauterizer	Fine Science	18010-00	Para selar quaisquer artérias ou veias cortadas durante a cirurgia para prevenir perda excessiva de sangue.
Balança Digital	Okaus	REV.005	Para pesagem do animal durante o preparo cirúrgico.
Acessório de agulha flexível	World Precision Instruments	MF34G-5	Para limpar agulhas de vidro e carregar óleo vermelho em agulhas de vidro.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Para selar o osso em caso de sangramento ósseo.
Instrumentos capilares de vidro	4878	precisão do mundo	dos tubos para agulhas de vidro puxadas - deve ser projetado para injetores do nanolitro.
Máquina de cortar cabelo	Oster	111038-060-000	Para limpar o local cirúrgico do cabelo.
Hemostats	Roboz	RS-7231	Para uso geral em cirurgia.
Kimwipes	Kimtech	34155	Para uso geral em cirurgia.
Fórceps Curvo de Ponta Média	Roboz	RS-5136	Para uso geral em cirurgia.
Micromanipulador com escala de nônio	Kanetec	N/A	Para direcionamento preciso durante a cirurgia.
Microscissors	Roboz	RS-5621	Para cortar chiados de vidro de tubos capilares de vidro recém-puxados.
Microscópio com Luz e Escala Vernier Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Usado para visualizar e medir o chanfro de tubos capilares de vidro puxados em agulhas de vidro funcionais.
Controlador de Bomba MicroSyringe	World Precision Instruments	62403	Para controlar a taxa de injeção.
Nanolitro 2000 Cabeça de Bomba Injetora	World Precision Instruments	500150	Para carregar e injetar vírus de forma controlada.
Extrator de agulhas	Narishige	PC-100	Para aquecer e separar tubos capilares de vidro para formar agulhas de vidro.
Pomada oftalâmica	Dechra Produtos Veterinários	RAC 0119	Para proteger os olhos do animal durante a cirurgia.
Parafilm	Bemis	PM-996	Para ajudar no carregamento do vírus no nanoinjetor.
Agulhas PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Para uso com as seringas de 1mL e 10 mL para permitir a injeção do modelo animal.
Fórceps de dente de rato	Roboz	RS-5152	Para processos espinhosos de gripe.
Óleo Vermelho	N/A	N/A	Para fornecer uma frente para visualização do vírus que entra no tecido durante a injeção.
Afastadores	Roboz	RS-6510	Para manter aberta a ferida cirúrgica.
Comprimidos Rimadyl	Bio Serv	MP275-050	Para controle da dor pós-cirurgia.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Para remover o músculo da coluna vertebral durante a cirurgia.
Cabo de lâmina de bisturi	Roboz	RS-9843	Para cortar a pele aberta e a almofada de gordura do modelo animal durante a cirurgia.
Tesoura	Roboz	RS-5980	Para uso geral em cirurgia.
inoxidável CellPoint		201-1000	Para ligar a pele da ferida cirúrgica durante o fechamento.
Pinça de remoção de grampos	Kent Scientific	INS750347	Para remover os grampos, caso sejam aplicados incorretamente.
Produtos de pesquisa estéreis	BP-989	Phenix	de pano Para fornecer uma superfície estéril para a operação.
Aplicadores estéreis com ponta de algodão	Puritan	806-WC	Para absorver o sangue na ferida cirúrgica, mantendo a esterilidade.
Gaze estéril	Covidien	2146	Para limpar a área cirúrgica e as ferramentas cirúrgicas, mantendo a esterilidade.
Solução salina estéril	Baxter Healthcare Corporation	281324	Para uso na limpeza do sangue e na reposição de fluidos pós-cirurgia.
Luvas cirúrgicas	N/A	N/A	Para uso pelo cirurgião para manter o campo estéril durante a cirurgia.
Almofada de aquecimento cirúrgica	N/A	N/A	Para manter a temperatura corporal do modelo animal durante a cirurgia.
Microscópio cirúrgico	N/A	N/A	Para uma melhor visualização da ferida cirúrgica.
Grampeador cirúrgico	Kent Scientific	INS750546	Para aplicar os grampos.
Bomba de água de terapia de calor T / Pump	Gaymar	TP500C	Para bombear água quente para a almofada de aquecimento de convecção de água.
Almofada de aquecimento de convecção de água	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Para uso na área de recuperação pós-operatória para manter a temperatura corporal do animal inconsciente.
Ganchos ponderados	N/A	N/A	Para manter aberta a ferida cirúrgica.

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