Artigo de método

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained

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DOI:

10.3791/3188

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16 de novembro de 2011

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1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-, ou clamp de insulina, é o padrão ouro para avaliar a ação da insulina In vivo. Um método para a realização de grampos de insulina em ratos é descrito. Isto inclui um método para cateterização arterial que permite experimentos a serem realizados no consciente, camundongos sem impedimentos, com o mínimo de stress.

Resumo

Diabetes tipo 2 é caracterizada por um defeito na ação da insulina. O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-, ou clamp de insulina, é amplamente considerado o "padrão ouro" método para avaliar a ação da insulina in vivo. Durante uma pinça de insulina, hiperinsulinemia é alcançado por uma infusão de insulina constante. Euglicemia é mantida através de uma infusão de glicose concomitante a uma taxa variável. Esta taxa de infusão variável de glicose (GIR) é determinada pela medição de glicose no sangue em breves intervalos durante todo o experimento e ajustar o GIR em conformidade. O GIR é indicativo de corpo inteiro ação da insulina, como os ratos com a ação da insulina maior exigem uma maior GIR. O grampo de insulina pode incorporar a administração de dois isótopos [14 C] deoxiglicose para avaliar tecido-específicos a absorção de glicose e [3-3 H] glicose para avaliar a capacidade da insulina de suprimir a taxa de aparecimento de glicose endógena (Endora), um marcador de produção hepática de glicose, e estimular ataxa de desaparecimento de corpo inteiro de glicose (Rd).

A miniaturização do clamp de insulina para uso em modelos de ratos genética da doença metabólica tem levado a avanços significativos na pesquisa do diabetes. Métodos para a realização de grampos de insulina variam entre os laboratórios. É importante notar que a maneira pela qual um grampo de insulina é realizada pode afetar significativamente os resultados obtidos. Nós publicamos uma avaliação exaustiva das diferentes abordagens para a realização de grampos de insulina em ratos conscientes 1, bem como uma avaliação da resposta metabólica de quatro comumente usado puras linhagens de camundongos através de técnicas de fixação diversos 2. Aqui apresentamos um protocolo para a realização de grampos de insulina sobre consciente, ratos desenfreada desenvolvido pelo rato Vanderbilt Metabólica Fenotipagem Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / MMPC). Isso inclui uma descrição do método para a implantação de cateteres utilizados durante o clamp de insulina. O protocolo empregado peloVanderbilt MMPC utiliza um sistema de 3 únicos dois cateteres. Um cateter é inserido na veia jugular para infusões. Um segundo cateter é inserido na artéria carótida, que permite a coleta de sangue sem a necessidade de conter ou lidar com o mouse. Esta técnica oferece uma vantagem significativa para o método mais comum de obtenção de amostras de sangue durante grampos insulina, que é a amostra da ponta da cauda decepada. Ao contrário deste último método, a amostragem de um cateter arterial não é estressante para o mouse 1. Descrevemos também métodos para usar infusões traçador isotópico para avaliar tecido-específicos a ação da insulina. Nós também fornecemos orientações para a apresentação adequada dos resultados obtidos a partir de grampos de insulina.

Protocolo

1. Preparação de cateteres e Antena Mouse para acesso de amostragem (MASA tm)

  1. Prepare cateter arterial através da inserção de um pedaço de 1,3 centímetros PE-10 (0,011 polegadas de diâmetro interno) em uma peça 6 cm de tubo silastic (0,012 polegadas de diâmetro interno), como mostrado na Figura 1A. Bevel a ponta do PE-10 com um bisturi para o comprimento a partir do final do silastic à ponta do chanfro é de 0,9 cm.
  2. Prepare cateter venoso deslizando um pedaço de 1 mm de tubo silastic (0,020 polegadas de diâmetro interno) 1,1 cm da ponta chanfrada de um pedaço 6 cm de tubo silastic (0,012 polegadas de diâmetro interno), como mostrado na Figura 1B. A peça de 1 mm de silastic é usado como um talão de restrição.
  3. Para preparar um tm MASA, insira cada um dos dois pedaços 1,3 cm de calibre 25 conectores de aço inoxidável em cada uma das duas 3 peças cm de PE-20 (0,015 polegadas de diâmetro interno).
  4. Assegurar a PE-20/connectors uns aos outros por um pedaço de correr 5 mm de silastictubulação (0,040 polegadas de diâmetro interno) sobre a área onde os tubos de aço e PE-20 se encontram.
  5. Dobre os tubos de aço a um ângulo de ~ 120 e separar cada tubo by ~ 45 °.
  6. Lugar preenchido na plataforma de um montão de adesivo de silicone médica de modo que a PE-20 tubo é vertical e as extremidades dos tubos de aço inoxidável se estendem além do adesivo (Figura 1C). Permitir que isso definido para 24h.

2. Cateterismo cirúrgica

  1. Antes da cirurgia, esterilizar cateteres com álcool 70%, preenchê-los com soro fisiológico heparinizado (heparina 200 U / ml de solução salina) e inserir plugues de aço inoxidável.
  2. Anestesiar mouse, de preferência usando um método que fornece continuamente o agente anestésico (isoflurano inalado por exemplo).
  3. Utilizando uma técnica asséptica, remover os pêlos dos locais incisão usando cortadores e / ou um creme depilatório e desinfectar a pele com álcool seguido por um matagal betadine. Para inserção do cateter, remover os pêlos naregião que se estende desde o maxilar inferior para a parte superior da caixa torácica e entre as clavículas. Para a externalização dos cateteres atrás da cabeça, remover os pêlos na área entre a base do crânio e na região interescapular e desinfectar a pele com álcool seguido por um matagal betadine.
  4. Lay o mouse sobre as suas costas em uma superfície de aquecimento e sob a área de visualização de um microscópio cirúrgico. Segura a cauda e extremidades com fita cirúrgica. Segura a cabeça no cone do nariz entregar a anestesia.
  5. Faça uma pequena incisão na linha média vertical, 5 milímetros cefálica ao esterno. Utilizando uma pinça, sem corte dissecar o tecido para expor o músculo esternocleidomastóideo esquerdo. Refletir este músculo para expor a artéria carótida esquerda. Gentilmente provocar off tecido conjuntivo da artéria. É importante neste momento para isolar o nervo vago a partir da artéria sem danificar tanto a artéria ou nervo.
  6. Isolar a artéria e ligar o final cefálica com fio de seda. Vagamente outro nópedaço de sutura na extremidade caudal do navio exposta.
  7. Grampo navio com uma pinça micro-serrefine na extremidade caudal e corte logo abaixo do final ligada com uma tesoura de mola. Insira cuidadosamente cateter até o grampo. Cuidadosamente solte a braçadeira micro-serrefine e avançar o cateter até a junção silastic-PE.
  8. Laço tanto ligaduras de forma segura para o cateter e confirmar que as amostras de cateter, ligando a extremidade livre do cateter a uma seringa de amostragem.
  9. Fazer outra incisão de 5 mm para a direita da linha média e cerca de 2 mm caudal à primeira incisão. Utilizando uma pinça, sem corte dissecar o tecido para expor e isolar a veia jugular direita.
  10. Cuidadosamente ligadura final cefálica com fio de seda e vagamente tie outro pedaço de sutura no final caudal.
  11. Corte logo abaixo da ligadura cefálica com tesoura primavera e inserir o cateter até o talão de restrição. Amarrar um fio atrás do talão e confirmar que as amostras do cateter.
  12. Turn o mouse sobre e fazer uma pequena incisão entre as omoplatas.
  13. Túnel de uma agulha de calibre 14 sob a pele da incisão para o cateter arterial, na parte da frente do mouse, a incisão interescapular nas costas. Passe o cateter arterial através da agulha para exteriorizar-lo na parte de trás do mouse. Repita este procedimento para o cateter da veia jugular por tunelamento a agulha de calibre 14 sob a pele no lado direito do mouse a partir do local da incisão na parte da frente da incisão interescapular nas costas.
  14. Prenda o cateter arterial com uma pinça micro-serrefine no local da incisão entre as omoplatas. Corte o cateter ~ 1 cm acima deste grampo. Coloque o tm MASA com os conectores de aço inoxidável de frente para a cabeça do mouse. Conectar o cateter arterial ao conector de aço inoxidável apontado para o lado esquerdo do mouse. Tome cuidado para garantir que não haja furos ou dobras no cateter. Repita o procedimento para o cateter venoso,conectá-lo ao conector de aço inoxidável apontando para o lado direito do mouse.
  15. Insira o tm MASA na incisão entre as omoplatas. A tubulação PE-20 correspondente ao cateter da veia jugular deve ser para o lado direito do mouse e do PE-20 tubos correspondentes ao cateter arterial deve ser para a esquerda.
  16. Fechar incisões ventral e dorsal, com fio de náilon. Para o fechamento dorsal, a sutura pode ser executado através do silicone endurecido do tm MASA para fixá-lo no lugar. Confirmar a permeabilidade dos cateteres usando uma solução de lavagem contendo salina heparinizada e um antibiótico para minimizar o risco de infecção. Colocar o mouse em uma gaiola, aquecido limpo para recuperação imediata. A Figura 2 mostra o produto acabado.
  17. Permitir que o mouse para recuperar pelo menos 5 dias. Monitor de peso e saúde em geral. Utilizar o regime de pós-operatório adequado analgésico aprovado pelo cuidado da instituição de origem animal eUse Comitê.

3. Hiperinsulinêmico euglicêmico-clamp

  1. Rápido o mouse por 5-6h. Como referência, o tempo t = 0 min refere-se ao final do jejum eo início da infusão de insulina e glicose (ou seja, período do grampo).
  2. A linha de configuração e tempo para um experimento típico são mostrados na Figura 3. Use tubulação de Micro-Renathane ou equivalente para infusão e linhas de amostragem. Suspender uma giratória dual-channel acima do mouse. Isto serve como um hub entre o mouse ea infusão / amostragem seringas. Durante o experimento, o rato permanece em uma gaiola ou recipiente similar e é preso à peça giratória.
  3. Antes de conectar o mouse, preencher a linha de amostragem arterial com solução salina heparinizada (heparina 10 U / ml solução salina) e coloque um conector de aço inoxidável na extremidade inferior da linha. Deixe uma seringa com solução salina heparinizada (clearing seringa) conectado à parte superior da linha de amostragem. Isso será usado para elaborar sangue samples.
  4. Preencha a linha de infusão venosa com soro fisiológico heparinizado não a partir da infusão da porta giratória (Segmento A na Figura 3A) todo o caminho até o fundo da linha. Conecte a extremidade superior da linha e colocar um conector de aço inoxidável (ou um conector Y-se um bolus deve ser administrada) na extremidade inferior da linha. Se um traçador isotópico de glicose (por exemplo, [3-3 H] glicose) está sendo infundido, segura uma seringa de 1 ml contendo o marcador para uma seringa de infusão. Preencha a linha de infusão venosa com traçador em vez de soro fisiológico (Figura 3B).
  5. Após três horas de jejum, pesar o mouse e conecte o PE-20 para a veia jugular e cateteres arterial para a perfusão e linhas de amostragem, respectivamente.
  6. Se a administração [3-3 H] marcador de glicose, iniciar uma infusão preparada traçador contínua em t = -90 min (Figura 3C). Uma dose priming típico é um μCi. Prepare um μCi 0,05 / mL [3-3 H] glicose solution em não heparinizado salina. Carregar a solução em uma seringa de 1 ml e segura a seringa na bomba de infusão. Administrar a dose priming, infundindo 20 l / min por 1 min. Seguir com uma infusão contínua de 0,05 μCi / min (1 ml / min) por um período de equilíbrio 90 min.
  7. Prepare infusatos de insulina e glicose. A insulina é preparada em não heparinizado salina contendo plasma 3% como um transportador (uma concentração adequada de BSA também pode ser usado). Infusatos glicose estão comercialmente disponíveis em uma variedade de concentrações (5%, 20 e 50).
  8. Prepare-salina lavados infusato erythorocyte pela obtenção de sangue total a partir de um camundongo doador, de preferência da mesma estirpe de fundo como o mouse experimental. Tipicamente de 1 ml de sangue total é necessária por rato estudo. Centrífuga de sangue para eritrócitos separados. Lavar os eritrócitos com soro fisiológico 10 U / ml heparinizado e centrifugar para descartar a solução salina. Determinar o volume de eritrócitos e ressuspender em um volume igual de 10 U / ml heparinized salina.
  9. Desenhar cada infusato em uma seringa de 1 ml e seguro para cada seringa uma bomba de infusão individual. Conectar cada seringa para um conector de 4 vias (Figura 3).
  10. Em t = -15 min tirar uma amostra de sangue pela lenta elaboração de 5-10 mL de sangue na seringa de compensação. Fixar a linha de amostragem arterial e retire a seringa de compensação. Usando um medidor de glicose de mão, faça uma leitura de glicose no sangue através da remoção do clamp na linha de amostragem arterial e permitindo que o sangue flua para a faixa de medidor de glicose.
  11. Uma vez que a medição de glicose é retirado, braçadeira da linha de amostragem arterial e inserir uma seringa com agulha romba (seringa de amostragem) para a linha de amostragem arterial. Retire o grampo e desenhe um volume de sangue (ver nota) para a seringa de amostragem. Fixar a linha de amostragem arterial e retire a seringa de amostragem. Inserir a seringa clearing de volta para a linha de amostragem arterial. Elaborar o êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar e re-infundir o5-10 mL de sangue que foi originalmente desenhado.

Nota: O volume de amostra de sangue depende da análise que está sendo executada. Por exemplo, a análise de [3-3 H] concentração de glicose requer 10 ml de plasma, de modo 50 ul de sangue são retirados. Isso rende 20-30 mL de plasma, que é suficiente para a análise mais plasma adicionais se necessário. Medições de hormônios e outros metabólitos (por exemplo, insulina, ácidos graxos livres) requerem amostragem de sangue adicional.

  1. Dispensar o sangue na seringa de amostragem em um microtubo EDTA. Centrífuga e recolher o plasma. Manter o plasma no gelo até o final do estudo ou imediatamente armazenar a -20 ° C.
  2. Repita os passos de 3,10 por 3,12 de t = -5 min. Obtenção de sangue adicional (50 mL) para a medição de níveis basais de insulina plasmática. Medida de hematócrito inicial por coleta de sangue em um tubo de heparina ou EDTA-tratados capilar. As medidas obtidas from amostras de plasma em t = -15 e -5 min representam basal (em jejum, por exemplo) valores.
  3. Após a amostra em t = -5 min, preencha as linhas de infusão para eritrócitos glicose, insulina e salino-lavadas até o conector de 4 vias. Ligue o conector de 4 vias para o tubo conectado à porta giratória de infusão (ou o tubo conectado ao conector Y se infundindo [3-3 H] glicose) como mostrado na Figura 3.
  4. Começar a infundir os eritrócitos lavados com solução salina em primeiro lugar. Definir a taxa de infusão para substituir o volume total de sangue a ser recolhida durante a duração do estudo (por exemplo, se um total de 500 mL de sangue são recolhidas durante 120 min do estudo, definir a taxa de infusão para 4,2 mL / min). Em contraste com a infusatos outros, a solução de eritrócitos é vermelho. Infundindo esta primeira solução permite que qualquer potencial de resistência ou obstruções nas linhas de infusão para ser identificada e corrigida.
  5. Uma vez que o infusato eritrócito chega ao mouse, iniciar a insulina einfusões de glicose. Esta é agora t = 0 min. A insulina é infundida a uma constante, a taxa pré-determinada. Uma taxa de infusão de insulina, de 4 mU • kg -1 • min -1 normalmente suprimir a produção endógena de glicose por 80-100% e estimular o desaparecimento de glicose por 2-3 vezes. A taxa de infusão inicial de glicose (GIR) é estimado com base na linha de base os níveis sanguíneos de glicose e experiência anterior.
  6. Se infundindo [3-3 H] glicose, pode-se optar por aumentar a taxa de infusão de traçador para coincidir com o aumento estimado no volume de negócios de glicose (tipicamente um aumento de 2-3 vezes).
  7. Considerando a alta taxa de rotatividade de glicose no mouse, amostras de sangue devem ser obtidas a partir da linha arterial pelo menos a cada 10 minutos para a medição da concentração de glicose ao longo da duração do experimento. Ajustar o GIR para atingir e manter euglicemia alvo (Figura 3C). Esta meta pode variar dependendo do modelo ou os objectivos do estudo. Um bom alvo glucose concentração é 150 mg • dL-1 uma vez que este é um nível de glicose em jejum 6h típico para um mouse C57Bl/6J chow-alimentados.
  8. O objetivo é conseguir euglicemia rapidamente, de preferência dentro do primeiro min 40-50, e de ter glicose e estável GIR até o início do período de steady-state (t = 80 min).
  9. Se infundindo [3-3 H] glicose, obter sangue adicional em t = 80, 90, 100, 110 e 120 min para a medição de plasma [3-3 H] a atividade de glicose específicos.
  10. Coleta de sangue adicionais em t = 100 e 120 min para a medição de insulina plasmática e qualquer outro hormônio (s) ou metabólito (s). Em t = 110 min, tirar sangue para um tubo de heparina ou EDTA-tratados capilar para a medição de grampo hematócrito.
  11. Após a amostra em t = 120 min é tomado, 2 [14 C] deoxiglicose pode ser administrada para a medição de tecido-específicos a captação de glicose. Administrar um bolus 12 μCi na linha de bolus conectado à linha de amostragem jugular (Figura 3B
  12. Obter amostras de sangue (50 ul) a partir da linha de amostragem arterial em t = 2, 15, 25 e 35 min após a administração do bolo para a medição de plasma 2 [14 C] deoxiglicose níveis.
  13. Após a última amostra, anestesiar o rato com uma infusão de pentobarbital dada diretamente na linha arterial. Rapidamente dissecar todos os tecidos necessários para a avaliação da absorção de glicose (por exemplo, músculos esqueléticos de vários tipos, tecido adiposo, coração, cérebro) e quaisquer outros tecidos (por exemplo, fígado, baço, rins). Snap tecidos congelar em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 ° C até serem analisadas. De glicose nos tecidos é analisado através da medição da acumulação de 2 fosforilada [14 C] deoxiglicose nos tecidos congelados e ao desaparecimento de 2 [14 C] deoxiglicose do plasma.

4. Resultados representante

Um exemplo dos resultados obtidos com um experimento clamp de insulina é mostrado na Figura 4.Este exemplo mostra a capacidade de uma dieta rica em gordura à resistência à insulina em ratos precipitar. Todas as apresentações de resultados de clamp de insulina deve incluir o seguinte a ser interpretáveis: um curso de tempo dos níveis de glicose no sangue, um curso de tempo do GIR e os níveis de insulina plasmática (linha de base e pinça). Como mostrado aqui, glicose de jejum (Figura 4A) e insulina (Figura 4C), os níveis são mais elevados em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura, indicativo de resistência à insulina. Apresentando uma evolução no tempo dos níveis de glicose ao longo do estudo clamp (Figura 4A) permite ao leitor avaliar como euglicemia foi mantida, o que é indicativo da qualidade do grampo. Da mesma forma, um curso de tempo do GIR (Figura 4B) permite que o leitor para determinar quão rapidamente um estado de equilíbrio foi alcançado. Mostrando esses dados como cursos tempo é significativamente mais informativa do que a prática convencional na literatura clamp do mouse insulina de apresentar uma experiência de 2 horascomo um ponto de referência único que representa valores médios de um período de "clamp" indefinido (13/04). No presente exemplo, os níveis de glicose foram iguais entre o controle e alto teor de gordura alimentados grupos, mas o GIR foi significativamente menor no alto teor de gordura alimentados grupo (Figura 4B). Isso é indicativo de uma deficiência em todo o corpo a ação da insulina. Níveis de insulina grampo também foram maiores no alto teor de gordura alimentados grupo (Figura 4C), um maior apoio à presença de um fenótipo de resistência à insulina nesses camundongos. O uso de infusões traçador isotópico permite a avaliação da ação da insulina em tecidos específicos. [3-3 H] glicose é utilizada para estimar a taxa de aparecimento de glicose endógena (Endora), que é um índice da produção hepática de glicose (HGP) ea taxa de desaparecimento de corpo inteiro de glicose (Rd). Enquanto a insulina elimina completamente HGP em ratos controle, esta é prejudicada em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura (Figura 4D). Da mesma forma, a capacidade de nossulin para estimular Rd em ratos controle é comprometida em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura (Figura 4E). 2 [14 C] deoxiglicose é usado para avaliar o índice metabólico de glicose (Rg), uma medida de tecido-específicos a captação de glicose. Como pode ser visto neste exemplo, a insulina estimulou-absorção da glicose no músculo esquelético é prejudicada em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura (Figura 4F).

Figura 1
Figura 1: Preparação da hipertensão arterial (A) e cateteres (B) e venosa (C) MASA tm. Cateteres arteriais são preparados através da inserção de um pedaço de 1,3 centímetros PE-10 cerca de 3 mm em um pedaço seis centímetros de 0,012 silastic ID ". A ponta PE-10 é chanfrado de tal forma que o comprimento do chanfro para o silastic é de 0,9 cm. Venosa cateteres são feitos deslizando um pequeno pedaço de 0,020 "ID silastic 1,1 centímetros a partir do final de uma peça chanfrada 6 centímetros de 0,012" silastic ID. Os 0.020 "ID atos pedaço silastic como um talão de restrição para si curar o cateter na veia jugular. Para montagem do tm MASA, cada um dos dois centímetros 1,3 de calibre 25 conectores é inserido em cada um dos dois pedaços 3 cm de PE-20. Estes são mantidos juntos por um pequeno pedaço de 0,040 silastic ID ". Os conectores são dobradas a um ângulo de 120 ° e separados em um ângulo de 45 °. Todo o conjunto é imerso em adesivo de silicone médico.

Figura 2
Figura 2: mouse cateterizada. Cateteres são implantados cirurgicamente na artéria carótida esquerda e da veia jugular direita. As extremidades livres dos cateteres são exteriorizadas por trás da cabeça e conectado a um tm MASA. O tm MASA é inserido por via subcutânea entre as omoplatas. Este permite o acesso vascular durante as experiências clamp de insulina sem a necessidade de controlar, manipular ou anestesiar o mouse.

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Figura 3: Representação da linha de configuração e tempo para um experimento clamp de insulina. O mouse é preso a um suporte giratório dual-channel que atua como um hub para infusão e seringas de amostragem. Configurações típicas para experimentos não usar infusões marcador (A) e utilizando ambos [3-3 H] glicose e 2 [14 C] deoxiglicose (B) são mostradas. Uma linha do tempo dos procedimentos de criação e realização do clamp de insulina (C) também é mostrado. Durante o clamp, amostras de sangue ( Sangue ) São tomadas a cada 10 minutos para medir glicose no sangue. O GIR é ajustada para manter a euglicemia. Amostras para a glicose sanguínea inicial, insulina plasmática e plasma [3-3 H] glicose são tomadas em t = -15 e -5 min. Amostras para grampo plasma [3-3 H] glicose são tomadas em t = 80, 90, 100, 110 e 120 e de insulina no clamp t = 100 e 120 min. 2 [14 C] deoxiglicose é administrado após a amostra em t = 120 min e blood é coletada em t = 2, 15, 25 e 35 min depois. Tecidos são tomadas após a amostra min t = 35.

Figura 4
Figura 4: Resultados de um experimento clamp de insulina comparando ratos em uma dieta controle (Chow) para ratos em uma dieta rica em gordura (DFH). Curso de tempo de glicose arterial (A) e insulina GIR (B) de base, e braçadeira (C), Endora (D) e Rd (E) e no músculo esquelético (gastrocnêmio e vasto lateral) Rg (F) são mostradas. Todos os resultados indicam o efeito da alimentação rica em gordura para induzir resistência à insulina.

Discussão

O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-, ou clamp de insulina, é amplamente considerado o "padrão ouro" método para avaliar a ação da insulina in vivo. Esta técnica tem sido aplicada para diversas espécies incluindo os humanos, cães, ratos e camundongos. Dado o número crescente de modelos de ratos transgênicos para distúrbios metabólicos, a miniaturização da técnica para uso no mouse tem proporcionado avanços significativos para a investigação metabólica.

Enquanto os conceitos por trás do grampo de insulina são simples, na prática existem diferentes abordagens para a realização de experimentos clamp de insulina. Este não é um ponto trivial, uma vez que a maneira pela qual a experiência é realizada afeta os resultados obtidos 1. Aqui nós apresentamos o protocolo usado pelo MMPC Vanderbilt. A distinção fundamental entre o nosso protocolo e que dos outros é que usamos um cateter arterial para a obtenção de amostras de sangue. Isto está em contraste com a abordagem mais amplamente utilizado de obtaining amostras de sangue, cortando a ponta da cauda 4, 7, 11, 12, 14-17. A vantagem da amostragem de um cateter arterial é que o experimento é conduzido em um rato consciente e irrestrita. Amostragem da cauda muitas vezes exige contenção e aumenta os índices de stress quando grandes amostras de sangue são adquiridas 1. Hormônios do estresse estimular a produção endógena de glicose e prejudicar a disponibilidade de glicose 18, 19, potencialmente dando a aparência de um fenótipo de resistência à insulina. Amostragem da cauda cortada pode exigir Animal Care especiais Institucional e aprovação do Comitê Use devido à sua natureza estressante. O procedimento de cateterismo arterial foi desenvolvido para evitar o estresse para o mouse de cortar a cauda.

Um aspecto fundamental da realização de grampos de insulina é a capacidade de manter euglicemia. Não há algoritmos que podem prever corretamente como o GIR deve ser ajustada com base em leituras de glicose no sangue. Como a cirurgia,pessoal conduzindo experimentos clamp de insulina vai se tornar proficientes em manter euglicemia razoável apenas através da experiência. É importante notar que devido à sua maior taxa metabólica dos dados obtidos a partir de estudos do mouse será inerentemente barulhentas. Isso faz com que a apresentação completa dos dados, incluindo os períodos de glicose e GIR e valores absolutos de insulina plasmática, Endora, Rd e Rg crucial para a capacidade de qualquer leitor a interpretar os resultados. As taxas de glicose de alto fluxo no mouse (aproximadamente 5 vezes superior à taxa em humanos) garante uma alta freqüência de amostragem de glicose. Enquanto o volume de sangue do mouse é limitado, uma frequência de amostragem mínima de uma vez a cada 10 minutos é necessário ter certeza de que uma pinça adequada foi alcançada.

Conforme mostrado na Figura 4, os níveis de insulina grampo pode ser diferente entre os grupos. Fatores como dieta intervenções, manipulações transgênicos ou diferenças em cepas de fundo pode afetar fasos níveis de insulina ting, que podem posteriormente afetar os níveis de insulina grampo. Interpretação dos resultados quando os níveis de insulina pinça são diferentes pode ser problemático. Isto pode ser experimentalmente solucionado através de experiências-piloto para selecionar taxas de perfusão de insulina que atingir níveis de fixação equivalente à insulina entre os grupos. Alternativamente, a somatostatina pode ser usado para inibir a secreção do hormônio pancreático e insulina e glucagon pode ser substituído a taxas controladas experimentalmente. Esta última abordagem é mais comumente feito em grampos de insulina em ratos do que os ratos. Se essas abordagens experimentais não forem tomadas, o GIR steady-state pode ser normalizada para o nível de insulina grampo, ou um índice de sensibilidade à insulina (S I) pode ser derivada a partir de dados como braçadeira S I = GIR / (G • ΔI), onde G é a concentração de glicose no steady-state e ΔI é a diferença entre jejum e concentrações de insulina grampo. Uma hipótese com qualquer abordagem é que o nível de insulina clamp alcançado édentro da faixa em que a sensibilidade à insulina é linearmente relacionada com o nível de insulina de acordo com o grupo estudado. Esta última hipótese pode não se aplicar ao comparar resistentes à insulina e grupos sensíveis à insulina. Idealmente, uma curva dose-resposta de insulina devem ser gerados para selecionar a infusão de insulina adequada. No entanto, devido a exigência de experimentos adicionais, isso raramente é feito.

A versatilidade fornecida pelo cateterismo arterial estende-se a abordagens experimentais para além grampos euglicêmico. Por exemplo, grampos hiperglicêmico, no qual a glicose é infundida a uma taxa variável para manter a hiperglicemia em relação à glicemia de jejum, pode ser usado para avaliar a função pancreática endógena in vivo 2, 20, 21. A medição da secreção de insulina durante a primeira fase deste teste requer a aquisição freqüente de amostras de sangue (ou seja, a cada min 2-5), o que não é viável quando a obtenção de amostras da ponta da cauda. Além disso,catecolaminas elevadas decorrentes da amostragem cauda pode prejudicar a secreção de insulina e glucagon aumentar a secreção 22. O protocolo de clamp de insulina também pode ser modificada para permitir a queda da glicemia para hipoglicemia relativa para avaliar contra-reguladores de resposta de 2, 23, 24. Cateterismo arterial também pode ser usado para avaliar a dinâmica do metabolismo da glicose durante o exercício 25-30. Isso é significativamente vantajosos em relação as abordagens convencionais realizados em momentos único pré e pós-exercício ou in vivo isolado músculos ex. As técnicas apresentadas aqui podem também ser usados ​​para avaliar não apenas a glicose, mas também o metabolismo de ácidos graxos 31.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Grant 5-U24-DK059637-10 para o Centro de Fenotipagem Vanderbilt rato Metabólica.

Referências

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. , (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

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