Ultrassom focalizado de alta intensidade para bloquear potenciais de ação nervosa em um modelo de rato diabético

Resumo

Fonte: Lee, Y. F., et al. Uma ferramenta ultrassônica para bloqueio de condução nervosa em modelos de ratos diabéticos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o uso de ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU) para bloquear os potenciais de ação do nervo ciático para o músculo gastrocnêmio em um modelo de rato diabético. Ao entregar o feixe HIFU ao nervo, uma diminuição no sinal muscular confirma o potencial do HIFU como terapia não invasiva para o alívio da dor neuropática diabética.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Bloqueio de condução nervosa in vivo com o transdutor de ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU)

NOTA: O experimento in vivo começa na semana 5 após uma injeção de estreptozotocina (STZ) de 50 mg/kg.

1. Realize procedimentos em animais antes de bloquear os potenciais de ação muscular compostos (CMAPs) com sonicação HIFU.
   1. Esterilize as ferramentas cirúrgicas (bisturi, tesoura, pinça e gancho de vidro) em autoclave antes da cirurgia.
   2. Anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de mistura de tiletamina / zolazepam (40 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) ou por inalação de 1,75% de isoflurano via vaporizador de isoflurano. Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal.
   3. Posicione os ratos para cirurgia em decúbito ventral. Aplique a pomada para os olhos. Estenda a perna do rato e aperte a superfície plantar do pé com as unhas para verificar a profundidade da anestesia. Se os ratos apresentarem respostas de retirada, aplique anestesia adicional.
   4. Remova o cabelo da coxa e da parte inferior das costas dos ratos com um aparador elétrico. Aplique iodo líquido com gaze limpa no local da cirurgia e mova circularmente a gaze para fora do local da cirurgia. Use uma compressa com álcool para limpar o iodo líquido com o mesmo movimento circular. Este experimento é realizado nos locais cirúrgicos esquerdo e direito. Repita o procedimento no outro local cirúrgico ao realizar a próxima etapa do procedimento.
   5. Use uma tesoura cirúrgica estéril ou bisturi para fazer uma incisão na pele na parte dorsal da coxa. Use uma tesoura cirúrgica sem corte para separar cuidadosamente o tecido sob a pele e prenda a pele com ganchos de pele. O fêmur pode ser visto dentro dos músculos.
   6. Use uma tesoura para separar cuidadosamente os músculos paralelos ao fêmur até que as fibras do nervo ciático do meio da coxa que estão embutidas nos músculos estejam visíveis. Use cuidadosamente um gancho de vidro para separar o nervo ciático do meio da coxa dos tecidos conjuntivos e músculos circundantes.
2. Posicione o nervo ciático na zona focal HIFU usando um fixador de nervo personalizado (Figura 1 e Figura 2).
   NOTA: O fixador de nervo personalizado consiste em 3 componentes (Figura 2). Todos os componentes são feitos de polimetilmetacrilato transparente (PMMA). A rosca externa da estrutura superior do componente I tem 2,5 mm de altura e M10XP0,7 (Figura 3A). O poço central é um orifício de 4,0 mm de diâmetro através do componente I. A abertura inferior do poço é selada por uma folha de fita adesiva. O diâmetro da ranhura é de 1,2 mm e a distância entre o plano central da ranhura e a superfície superior do componente I é de 3,1 mm. O componente II consiste em um corpo principal, quatro pernas e a estrutura inferior (Figura 3B). A rosca interna da estrutura inferior tem 2,5 mm de altura e M10XP0,7 para encaixar na rosca externa do componente I. O diâmetro do furo central é o mesmo que o poço central do componente I. As dimensões do corpo principal são 32 mm de diâmetro e 5,4 mm de espessura. Quatro pernas são implantadas simetricamente. Duas pernas curtas idênticas são projetadas para alinhamento e duas pernas longas idênticas funcionam para enganchar no componente III. O diâmetro externo e a altura do componente III são 41 mm e 9,2 mm. A rosca interna é M36XP1.0 e o orifício passante tem 27,5 mm de diâmetro (Figura 3C). O cone é um cone oco com uma abertura superior de 84 mm de diâmetro e uma abertura inferior de 27,5 mm de diâmetro. A altura é de 57,5 mm (Figura 4A).
   1. Antes do experimento, mergulhe o fixador de nervo acrílico feito sob medida em solução de alvejante por 30 a 60 min, seguido de imersão em água estéril.
   2. Usando um gancho de vidro, levante o nervo com cuidado e coloque-o na ranhura do componente I.
   3. Aparafuse o componente II ao componente I. Encha o poço central do componente I com solução de Ringer para propagação ultrassônica e preservação do nervo.
   4. Aparafuse o componente III ao cone da carcaça HIFU. Encaixe o componente III com o componente II através das quatro pernas do componente II.
      NOTA: O centro geométrico dos três componentes e o transdutor estão alinhados. A distância entre o nervo e o transdutor é igual à distância focal, o que garante que o nervo esteja dentro da zona focal HIFU.
3. Insira um par de agulhas de acupuntura na origem do nervo ciático e o outro par no músculo gastrocnêmio. Conecte cada par de agulhas ao sistema de aquisição de eletrofisiologia por meio de um cabo coaxial elétrico (Figura 1).
   NOTA: Em uma extremidade do cabo há duas garras jacaré para prender duas agulhas separadamente e, na outra extremidade do cabo, há um conector Neill-Concelman (BNC) de baioneta para conectar o sistema. Os pares de agulhas de acupuntura funcionam como eletrodos estimulantes no nervo ciático e os eletrodos de registro no músculo gastrocnêmio.
   1. Defina a taxa de amostragem e a largura de banda do sistema de aquisição de eletrofisiologia para 50 kHz e 70 Hz-3 kHz, respectivamente. Aplique um estímulo supramáximo com uma largura de pulso de 0,1 ms aos eletrodos de estimulação na origem do nervo ciático.
   2. Registre os CMAPs dos eletrodos de gravação e amplifique os CMAPs com o amplificador embutido no sistema de aquisição de eletrofisiologia.
      NOTA: Use o amplificador embutido no sistema de aquisição de eletrofisiologia para amplificar os sinais nervosos e registrar os CMAPs dos eletrodos de gravação com o sistema de aquisição de eletrofisiologia.
4. Use um transdutor HIFU comercial de 2.68 MHz para suprimir os CMAPs em ratos neuropáticos diabéticos.
   NOTA: As especificações do transdutor são descritas a seguir: uma tigela esférica de elemento único com diâmetro de abertura de 6 cm e distância focal de 5 cm, e uma zona focal elipsóide de 4 mm de profundidade e 0.8 mm de largura em campo livre.
   1. Mergulhe o cone esférico, o transdutor HIFU e a tampa do cone no tanque cheio de água desgaseificada. Coloque o transdutor HIFU no cone esférico e fixe a tampa do cone na abertura superior do cone esférico com seis parafusos de cabeça (Figura 4B). Depois que as bolhas no cone esférico forem expelidas naturalmente devido à baixa densidade de bolhas em comparação com a água, sele a abertura frontal do cone com uma fita transparente de 0,03 mm de espessura. Aparafuse o componente III no cone esférico.
   2. Retire o transdutor HIFU com o cone esférico e o componente III do tanque de água desgaseificada.
      NOTA: A água de osmose reversa (RO) usada no estudo é a água purificada pelo processo de osmose reversa. A água RO é fervida para expelir o gás. Após o resfriamento, a água desgaseificada é obtida em um tanque selado individual.
5. Coloque o componente I no espaço entre o nervo e o músculo com cuidado e posicione o nervo na lacuna do componente I. Execute as etapas 1.2.3 e 1.2.4 para garantir que o nervo esteja dentro da zona focal do HIFU (Figura 2A).
6. Conecte um gerador de funções e um amplificador de potência de radiofrequência. Conecte a potência amplifier ao transdutor HIFU para gerar o feixe HIFU. Defina manualmente o voltage saída do gerador de função para o transdutor HIFU através do amplificador de potência. Desligue manualmente o gerador de funções assim que o tempo de exposição HIFU terminar. Observe o tempo usando um temporizador.
   NOTA: A intensidade e a energia do feixe HIFU usado neste estudo são 2,810 W/^cm2 e 84 J/^mm2, respectivamente.
7. Simultaneamente, entregue o estímulo através do sistema de aquisição de eletrofisiologia (etapa 1.3) e feixe HIFU através do sistema HIFU (etapa 1.6) para o nervo ciático enquanto registra os CMAPs. Aumente gradualmente a exposição ao HIFU no nervo ciático de 3 s, 5 s para 8 s até que seja observada uma diminuição ou inibição da amplitude dos CMAPs.
   1. Registre os CMAPs uma vez por segundo durante a entrega do feixe HIFU. Após observar a mudança na amplitude dos CMAPs, desligue o sistema HIFU e clique manualmente no ícone de gravação no software de aquisição de eletrofisiologia para registrar CMAPs a cada 2 min nos primeiros 10 min, a cada 5 min nos 30 min consecutivos e a cada 10 min na última fase até que o tempo de gravação atinja 2 h.
8. Separe os componentes II e III do fixador de nervo (Figura 2) para remover o transdutor HIFU do local da incisão. Separe os componentes II e I para liberar o nervo ciático protegido. Suturar o sítio cirúrgico do rato diabético com suturas de categute crômico 4-0 após o registro dos CMAPs. Aplique iodo líquido no local da cirurgia para prevenir infecções.
   1. Coloque as gaiolas na almofada de aquecimento e permita que os ratos se recuperem em suas gaiolas antes de devolvê-los ao biotério. Forneça aos ratos ibuprofeno na água potável por 3 dias ou uma injeção intraperitoneal de buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg).
9. Insira eletrodos estimulantes e de registro na origem do nervo ciático e dos músculos gastrocnêmios de ratos neuropáticos diabéticos anestesiados, conforme descrito nas etapas 1.1.2 e 1.3 nos dias 7, 14 e 28 após a sonicação inicial do HIFU.

Resultados

Figura 1: A Configuração Experimental para Bloqueio de Condução Nervosa In Vivo com Ultrassom Focalizado de Alta Intensidade (HIFU). (A) Um cone esférico acrílico feito sob medida que é preenchido com água desga...

Materiais

< >< classe da tabela = 'tabela '>< tabela redimensionada'>< col estilo = 'largura: 33,33%;' estilo col = 'largura: 33,33%;'>< estilo col = 'largura: 33,34%;'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários EstreptozotocinSigma85882Biopac MP36 sistema de aquisiçãoBiopac Systems, Inc. Transdutor HIFUSonic ConceptsH108Gerador de funçãoAgilent33250AAmplificador de potênciaEletrônica & Inovação1040LRatosBiolasco taiwanSprague-DawleyPuralube pomada veterináriaDechra Vaporizador de isofluranoParkland ScientificV3000PSIsofluranoAttane