Imagem da dinâmica do cálcio subcelular em neurônios de Caenorhabditis elegans

Resumo

Fonte: Doser, R., et al. Imagem subcelular do manuseio de cálcio neuronal in vivo. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra imagens in vivo do fluxo de cálcio subcelular nos neurônios do cordão nervoso ventral de cepas transgênicas de Caenorhabditis elegans. Dois indicadores distintos de cálcio são empregados: um indicador citoplasmático em uma cepa e um indicador mitocondrial em outra. Os neurônios são observados sob um microscópio de fluorescência para monitorar mudanças em tempo real na intensidade da fluorescência no citoplasma neuronal e nas mitocôndrias, refletindo o fluxo de cálcio durante a atividade neuronal espontânea

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Protocolo

1. Preparação de vermes para imagem

1. Preparando as almofadas de ágar
   1. Faça 3 mL de ágar 10% dissolvendo ágar de grau molecular em M9 em um tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm e microondas por vários segundos.
      NOTA. O ágar fundido pode ser mantido em um bloco de calor por até 1 h ou pode ser feito fresco sempre que forem necessárias almofadas de ágar.
   2. Coloque uma lâmina de microscópio entre duas lâminas adicionais, cada uma com duas camadas de fita de laboratório (consulte a Figura 1A-i).
   3. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1.000 μL (sem filtro) e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar na lamínula central (Figura 1A-i).
   4. Alise o ágar pressionando outra corrediça para baixo na parte superior do ágar (Figura 1A-ii).
   5. Após o arrefecimento, cortar o ágar-ágar num pequeno disco utilizando a abertura de um tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm (figura 1A-iii) e, em seguida, retirar o ágar circundante.
2. Preparando a solução de rolamento de minhoca
   1. Dissolver o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 mM. Separe em alíquotas de 50 μL e armazene a 4 °C.
   2. Descongelar uma nova alíquota de 30 mM de muscimol de 3 em 3 a 5 dias (e conservar a 20 °C durante a utilização).
   3. Dilua um estoque de muscimol 30 mM na proporção de 1:1 com esferas de poliestireno para fazer a solução de laminação.
3. Posicionando um verme para imagem
   1. Coloque 1,6 μL da solução de rolamento no centro da almofada de ágar.
      NOTA: A quantidade de líquido deve ser ajustada para imagens de animais mais jovens (menos) ou mais velhos (mais).
   2. Usando o picareta de minhoca preferida (ou seja, uma palheta de fio de vidro ou platina), transfira um verme da idade desejada sem o fenótipo multivulva para a solução de rolamento na almofada de ágar (Figura 1A-iv). nota. Os dados representativos são de hermafroditas de 1 dia de idade (cepa GCaMP6f = FJH185; cepa mitoGCaMP; FJH597), que pode ser identificada pela presença de apenas uma fileira de ovos.
   3. Aguarde ~ 5 min para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma lamínula de 22 mm x 22 mm em cima da almofada do ágar, restringindo fisicamente o movimento do verme.
   4. Para imagens de neurites no cordão nervoso ventral, role o verme na orientação mostrada nas Figuras 1B e 1C deslizando levemente a lamínula.
      NOTA. Para visualizar o cordão nervoso ventral, posicione o verme com a cabeça para cima e role o verme até que o intestino esteja no lado direito da porção proximal e à esquerda para a porção distal do verme (da perspectiva do observador). Inverta essa orientação (Figura 1C) para obter imagens de neuritos no cordão nervoso dorsal.
4. Montagem do sem-fim em um microscópio
   1. Coloque uma gota de óleo de imersão na lamínula antes de montá-la no microscópio stage.
   2. Encontre o verme usando uma objetiva de baixa ampliação (10x) em campo claro.
   3. Mude para a objetiva de 100x e ajuste o foco.
   4. Localize o neurite AVA usando a iluminação do GCaMP ou mitoGCaMP com o laser de imagem de 488 nm.
      NOTA: Use pequenos ajustes para evitar esmagar o verme ou arrancar a lamínula.

2. Aquisição de fluxos de imagens de alta resolução

1. In vivo GCaMP imaging
   1. Defina o tempo de exposição para 20 ms.
   2. Ajuste as configurações de aquisição e laser de imagem até que a fluorescência basal do GCaMP esteja na faixa intermediária da faixa dinâmica da câmera. Consulte a discussão para obter sugestões sobre como otimizar os parâmetros de imagem usando outras configurações de microscopia.
      NOTA: Para a configuração óptica usada neste estudo, defina o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 50% e atenuação = 1. Modifique as configurações de aquisição adicionais da seguinte forma: EM elétrons multiplicando) ganho = 200 e pré-ampganho do amplificador = 1.
   3. Depois que o neurite AVA for localizado usando a fluorescência GCaMP com ampliação de 100x, defina o corretor de desvio Z (ZDC, consulte a Tabela de Materiais) para uma faixa de ±30 μm e inicie o foco automático contínuo. Corrija manualmente o plano focal conforme necessário antes de criar imagens.
   4. Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x. Durações de até 10 minutos podem ser alcançadas com a configuração usada neste estudo.
2. In vivo mitoGCaMP imaging
   1. Siga as etapas 2.1.1 a 2.1.2 conforme necessário para adquirir a fluorescência mitoGCaMP basal na faixa intermediária para a faixa dinâmica da câmera.
      NOTA. Para a configuração óptica usada neste estudo, defina o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 20% e atenuação = 10. Modifique as configurações de aquisição para o seguinte: Ganho EM = 100 e pré-ampganho do amplificador = 2.
   2. Depois que as mitocôndrias na neurite AVA estiverem localizadas usando a fluorescência mitoGCaMP, defina o ZDC conforme descrito acima na etapa 2.3.
   3. Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x.

Resultados

Figura 1: Montagem e rolagem de C. elegans para imagens do cordão nervoso ventral. (A) Uma ilustração das etapas para preparar as almofadas de ágar e pegar um único verme em uma solu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100x/1.40 Objetiva de óleo	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Olympus			UPlanSApo
22 mm x 22 mm Vidro de cobertura	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
CleanBench	TMC		Com controlo de vibrações
Roda de filtro ou corrediça	ASI		Para filtros de 25 mm de diâmetro
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Estirpe de vermes
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Estirpe de vermes
GFP filtro de emissão passa-banda	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm de diâmetro)
Combinador de laser ILE	Andor Technologies		4 linhas de laser
ILE laser de estado sólido 488 nm	Andor Technologies		50 mW
IX83 Microscópio confocal de disco giratório	Olympus		Com disco giratório Yokogawa CSU-X1
iXon Ultra EMCCD câmera	Andor Technologies
Óleo de imersão de baixa autofluorescência	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Versão 7.10.1
Caixa de controle do microscópio	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
Microesferas de poliesferas	Policiências Inc.	00876-15	0,094 μm
Câmara de estabilidade	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Ajustado para 15 °C
Controlador de palco	ASI		Com controle de roda de filtro
Lâmina de microscópio padrão	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Controlador de painel de toque	Corretor de desvio Z Olympus		I3-TPC
	Olympus		IX3-ZDC2

Mesa de laboratório