Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Resumo

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de afinidade E. coli Seguido de cromatografia de troca aniônica, His6 tag-remoção com protease TEV e tamanho-exclusão cromatografia.

Resumo

Hsp104 é um hexamérica AAA + ¹ proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP para a proteína desagregação ^10/02 (Fig. 1). Esta atividade dá dois principais vantagens seletivas. Primeiro, renaturalização de agregados desordenada por Hsp104 capacita sobrevivência levedura após várias proteínas-misfolding salienta, incluindo choque térmico ^3,5,11,12. Em segundo lugar, a remodelação das fibrilas de cross-beta-amilóide por Hsp104 permite levedura para explorar prions miríade (amilóides infecciosas) como um reservatório de benéfico e hereditárias variação fenotípica ^13-22. Notavelmente, Hsp104 diretamente remodela oligômeros preamyloid e fibrilas amilóides, incluindo aqueles composto de proteínas de levedura prion Sup35 e Ure2 ^23-30. Esta funcionalidade amilóide remodelação é uma faceta especializados de levedura Hsp104. O E. orthologue coli, ClpB, não oligômeros remodelar preamyloid ou fibrilas amilóides ^26,31,32.

Orthologues Hsp104 são encontrados em todos os reinos da vida, exceto, perplexidade, os animais. De fato, se as células animais possuem qualquer sistema enzimático que os casais desagregação proteína para renaturalização (ao invés de degradação) permanece desconhecido ^33-35. Assim, nós e outros propuseram que Hsp104 pode ser desenvolvido como um agente terapêutico para várias doenças neurodegenerativas relacionadas com o misfolding de proteínas específicas em oligômeros preamyloid tóxicos e fibrilas amilóides ^{4,7,23,36-38.} Não existem tratamentos que visam directamente as espécies agregados associados a estas doenças. No entanto, se dissolve Hsp104 oligômeros tóxicos e fibrilas amilóides composto de alfa-sinucleína, que são conectados com Doença de Parkinson ^23, bem como formas de amilóide de PrP ^39. Importante, Hsp104 reduz a agregação da proteína e melhora a neurodegeneração em modelos de roedores da doença de Parkinson ²³ e doença de Huntington ^38. Idealmente, para otimizar o tratamento e minimizar os efeitos colaterais, Hsp104 seria projetado e potencializadas para seletivamente remodelar agregados específicos central para a doença em questão ^4,7. No entanto, a limitada compreensão estrutural e mecânica de como Hsp104 desagrega um repertório tão diversificado de estruturas agregadas e proteínas não relacionadas frustra estes esforços ^30,40-42.

Para compreender a estrutura e mecanismo de Hsp104, é essencial para estudar a proteína pura e reconstituir a sua actividade disaggregase com componentes mínimos. Hsp104 é uma proteína 102kDa com um pI de aproximadamente 5,3, que hexamerizes na presença de ADP ou ATP, ou em concentrações da proteína na ausência de ^43-46 nucleotídeos. Aqui, nós descrevemos um protocolo otimizado para a purificação de altamente ativa, Hsp104 estável de E. coli. O uso de E. coli simplificado permite produção em larga escala e nosso método pode ser realizado de forma rápida e confiável para inúmeras Hsp104 variantes. Nosso protocolo aumenta Hsp104 pureza e simplifica a sua remoção ₆ tag em comparação com um método de purificação prévia do E. coli ^47. Além disso, o nosso protocolo é mais fácil e conveniente do que dois protocolos mais recentes ^26,48.

Protocolo

1. Expressão de Hsp104

1. O plasmídeo utilizado para a purificação em E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contém o Hsp104 estrutura aberta de leitura sob o controle do promotor induzível trc ^26. O plasmídeo produz Hsp104 com um N-terminal Seu ₆ tag que pode ser removido por clivagem da protease TEV. PPROEX transformar-HTB-Hsp104 em códon otimizado E. coli BL21-CodonPlus-RIL células (Stratagene, Agilent Technologies) usando um procedimento típico de transformação bacteriana (por exemplo, de acordo com as instruções do fabricante). É importante usar um E. códon otimizado coli cepa Hsp104 porque tem um v....

Discussão

Cronograma: Para a atividade Hsp104 máxima recomendamos que o sistema de purificação de todo ser concluída o mais rapidamente possível. No entanto, o número de etapas de purificação torna um calendário exigente, que nem sempre pode ser prático. Se as etapas de purificação são realizadas o mais rapidamente possível, o tempo a partir do final de expressão durante a noite até a 2-4 horas de incubação a 30 ° C com TEV protease é de aproximadamente 9-11 horas. Um lugar potencial para fazer uma pausa está seguindo o pa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
BL21-CodonPlus-RIL células competentes	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT caldo	USB	75864
Completo, mini, EDTA livre inibidor da protease comprimidos	Roche	1836170
A Pepstatin	Sigma	P4265
Ni-Sepharose 6 Fluxo Rápido	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 centrífuga unidades de filtro (MWCO 30.000)	Millipore	UFC903008
Resource Q - coluna 6ml	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV Protease	Promega	V6052
AcTEV Protease	Invitrogen	12575015
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Designs ensaio	SPP-400
Hsp72	Designs ensaio	ADI-NSP-555