Summary
Biz bir tarif
Abstract
Şiştozom parazitler etken schistosomiasis kronik zayıflatıcı hastalığı, dünyada 200 milyon insanı etkileyen ve halk sağlığı ve sosyo-ekonomik etkileri (1-4) açısından paraziter hastalıklar arasında sıtma ile ikinci sırada yer alıyor. Şiştozom parazitler karmaşık bir yaşam döngüsü serbest yüzen aşamalarında müdahale molluscan ve memeli ev sahipliği yapan asalak bir yaşam arasındaki ¤ lantılarını trematod solucanlar. Kısaca, serbest yüzen cercariae schistosomules dönüşürken, cercariae kuyrukları kaybetmek ve bu süre boyunca salgılanan proteazlar yardımı ile cilde nüfuz konak memeli bozar. Schistosomules şimdi, konak bağışıklık sistemini kaçınmak, kırmızı kan hücrelerinin bir bağırsak sindirim için geliştirmek ve göç gerekir rağmen akciğer ve karaciğer portal sisteminin nihai hedefe giderken portal dolaşıma ve sonunda mezenterik damarlar (S. mansoni ) erkek ve dişi solucanlar çifti ve arkadaşı, her gün yüzlerce yumurta üretmek. Bazı yumurta, taze su, serbest yüzen miracidia (5-10) içine yumurtadan çıkar yumurta içine vücuttan atılır. Miracidia özel salyangoz türleri enfekte ve anne ve kızı da, yaşam döngüsünü tamamlayarak, enfektif cercariae üretmek sporocysts dönüşmek. Ne yazık ki, tüm şiştozom yaşam döngüsü in vitro kültüre, ancak infektif cercariae schistosomules dönüşebilir ve schistosomules vitro veya mikroarray analizi şiştozom gelişme analizi için hafta boyunca kültüre olabilir. Bu protokol, biz cercarial dönüşüm ve schistosomules in vitro kültür görsel bir açıklama sağlar. Biz salyangoz ana Biomphalaria glabrata bulaşıcı cercariae döken ve elle, bir bulamaç çift uçlu bir iğne kullanarak kendi kuyrukları ayırarak schistosomules haline dönüştürmek. , In vitro cercarial dönüşümü ve schistosomules kültür teknikleri, schistosomes, görselleştirme kolaylaştırır ve deneysel analizi için parazit toplanmasını kolaylaştırır. In vitro dönüşüm ve kültür teknikleri schistosomes yıl için yapılmış bir konak memeli, (11 kullanımını önlemek açıklanan 12), ancak hiçbir görsel protokoller tüm toplum için kullanılabilir olduğunu geliştirilmiştir var.
Protocol
Güvenlik önlemleri:
Şiştozom cercariae bir kesik veya gözeneklerin ihtiyaçları olmadan doğrudan cilde nüfuz eder ve kronik hastalık schistosomiasis neden olabilir. S. mansoni bir biyogüvenlik düzeyi 2 organizma, bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman ve enfektif cercaria ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri takip edilmelidir. Schistosomes büyümeye dönüştürmek için gerekli ekipmanların çoğu protokol sonunda tabloda belirtildiği gibi birkaç önemli istisnalar dışında, standart. Tüm cercarial çalışma, izole bir odada yapılmalıdır. Schistosomules steril, onaylı biyogüvenlik kaput kültüre olmalıdır. İki kat nitril ya da lateks eldiven giyilmelidir bir laboratuvar önlüğü, su geçirmez bir çift ayakkabı, bilek ve silah için herhangi bir delik veya yırtık ve su geçirmez kol koruyucuları pantolon gerekir. Kazara dökülme durumunda, derhal şiddetle kişi hakkında ise sürtünme,% 70 etanol veya% 10 çamaşır suyu ile kirlenmiş alanda sprey. Bu parazit devre dışı bırakmak için yeterli olacaktır, ancak tüm olası enfeksiyonlara ve ciddiye alınmalıdır. Schistosomules doğuştan enfektif olmasa da, kurumsal kurallar değişir ve BSL2 önlemler noninfeksiyöz yaşam aşamalarında gerekli olup olmadığını belirlemek için danışılmalıdır. Biohazard onaylı bir kapta yapılır ve deney atık atmak sonra herhangi bir potansiyel bulaşıcı madde ile temas eden tüm yüzeyler dezenfekte edin.
NOT: Kapak salyangoz ana bidonları, 1 ila 2 gün önce dökülme ve ışıktan korumak için
1. Salyangoz konak cercariae Hasat
- Yarım distile su ile oda sıcaklığına gelmesi dolu deterjan, 500ml temiz bir behere doldurun. Farklı tarihlerde miracidia ile enfekte konak salyangoz ile çalışıyorsanız, her enfeksiyon tarih için ayrı bir beher kullanmak (salyangoz gelecek deneyler için tekrar olacak, bu özellikle önemlidir). Beher boyutu da kullanıcı deneyimine bağlı olarak daha küçük olabilir.
- Gerektiği gibi net bir standart akvaryum balığı ve genel amaçlı forseps kullanarak beher döken ve dikkatli bir şekilde yatırmak isteyen enfekte salyangoz ev sahipliği toplayın.
- Acil bir dökülme Yeri beher akkor bir ışık kaynağı altında yaklaşık 8 ila 12 inç tepsisi. Işığı altında 1-2 saat bekletin. Parlak ışığa maruz kaldığında Cercariae salyangoz konak çıkın.
- Cercariae karışımı dikkatlice salyangoz dışarı filtre. Karışımının son derece bulaşıcı olduğundan, ekstra güvenlik önlemleri alın. Unutmayın, cercariae doğrudan insan derisi nüfuz edebilir!
- Herhangi bir partikül atık madde yerleşmelerine izin verme, yaklaşık 15 dakika ışık kaynağı altında karışımı değiştirin.
- Cercariae beher altındaki enkaz kaçınarak, bir pipetlemeyin kullanarak temiz bir Erlenmeyer şişesinin içine aktarın. Şişesi 60 dakika, cercariae bir köşeye yerleşmek için izin - 45 için karanlık buz üzerinde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin.
- Süpernatantı 75 -% 90% 10 çamaşır suyu ya da% 70 etanol içeren beher kaldırmak ve mevduat, su damlaları pipetlemeyin cercariae damla içeren girmemesine dikkat çekici bir 50 ml pipetlemeyin kullanın.
- Swirl Erlenmeyer şişesinde çözüm cercariae tekrar süspansiyon yavaşça cercariae içeren. Steril 50 ml konik tüpler için örnek aktarmak için bir pipetlemeyin kullanın. Karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde tekrar tüpleri yerleştirin. Cercariae karanlıkta tüp alt kısmına doğru geçer.
2. Schistosomules için cercariae Manuel dönüşüm
Başlamadan önce: RPMI 1640 (RPMI,% 5 fetal sığır serumu, 1X Pen / Strep) tamamlamak ve 37 ° C'ye kadar sıcak olun. (Kullanılan fetal sığır serumu inkübasyon inaktive edildiğini çok önemlidir 56 ° C 1 saat schistosomes tamamlamak için duyarlı olmak gibi).
- Biohazard kaput, her biri 50 ml konik bir pipet veya vakum cihazı kullanılarak çözüm 5 ila 10 ml kadar süpernatant çıkarın.
- Döner lok uygun boyutta bir şırınga iğnesi bulamaç, çift uçlu, 22 gauge takın.
- Yavaş yavaş şırınga içine karışımı çizin. Bir şırınga içinde 50 ml tüpler cercariae toplayın. Damlayan dikkatli olun.
- Unattached iğne ucu kadar olduğu gibi üzerinde dikkatle şırınga açın. Bulamaç iğne bu tarafında başka bir şırınga takın.
- Cercariae dönüştürmek için iğne ile toplam 40 kez (20 kez ileri ve geri) Pass karışımı.
- Karışım, alt şırınga bulunan ve üst şırınga boş olduğunu dikey gibi şırınga yerleştirin. Üst şırınga çıkarın ve% 70 Etanol dezenfekte.
- Mevduat karışımı temiz bir yüksek duvarlı 100mm x 50mm kabına ya da kristalize çanak içine damla damla. % 70 Etanol iğne ve şırınga dezenfekte edin.
- 37 ° C RPMI 1640 eksiksiz bir medya gibi ekleyinPetri kabı alt Luria suyu plakası dökme gibi tamamen kaplıdır.
- Petri kabı merkezinde schistosomules toplamak için hafifçe Swirl. Sıçramasını önlemek.
Not: Bu adım için daha yeterli merkezinde schistosomules görselleştirmek için kaput ışığı kapatmak için yararlı olabilir. - Hemen steril bir damlalık kullanarak yeni bir 12-kuyu hücre kültür plakasına konsantre schistosomules yatırın.
- 2.9 ve 2.10 schistosomules artık çanak (yaklaşık 10 kat) merkezi bugünkü kadar tekrarlayın. Sonraki her taze bir kuyu koleksiyonu Depozito.
- Her iyi yarısına kadar (~ 1.5 mL) prewarmed RPMI tam medya ile doldurun.
- Schistosomules varlığı ve cercariae yokluğu doğrulamak için bir inverted mikroskop gözünüzde canlandırın.
- Büyümeye CO 2 inkübatör schistosomules - 37 ° C ve% 5 CO 2.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Kültür ortamı haline dönüştürülmüş schistosomules Bekleyen transferi, ters bir parlak alan mikroskobu altında (örneğin ekipman tabloya bakınız) görselleştirme Şekil 1, sadece dönüştürülmüş schistosomules iyi olduğu için benzer bir görüntü elde edilmelidir. Potansiyel kirleticiler, sağlam cercariae, kopmuş cercarial kuyrukları, veya diğer çöküntüleri içerebilir. Hiçbir inverted mikroskop varsa, standart bir mikroskop ya da hatta bir diseksiyon kapsamı schistosomules görselleştirmek için yeterli olacaktır. Bu işlem her zaman% 100 cercariae dönüştürmek unutmayın.
Şekil 1: Dönüştürülmüş Schistosomulum
Şekil 2: Cercariae ve Severed Tails
Discussion
Bazı potansiyel sorunları dönüşüm işlemi sırasında ortaya çıkabilecek; Ancak, bu protokol, bu sorunların en önlemek için tasarlanmıştır. Potansiyel bir tehlike genellikle adım 1.3 'de hasat arta kalan enkaz nedeniyle ortaya çıkar bulamaç iğne, tıkanma. Bu sorunu önlemek için tüm partikül madde, 1.5 adım yerleşmek ve adım 1.6 cercariae dikkatli bir şekilde aktarmak için izin emin olun. Ayrıca, biyolojik güvenlik kabini içinde çalışmak, daha önce açıklandığı gibi, kişisel koruyucu ekipman kullanımı (hatta yüz kalkanlar) ve şırınga aşırı basınç kaçınma tavsiye edilir.
Müstakil cercarial kuyrukları 2.9 adım sırasında kötü ayrılması göstergesidir medya, görüntülenebilir. Kuyrukları spazm gibi hareket sergiler ve farklı bir şekil var (bkz. Şekil 2) ve thusly schistosomules kolayca ayırt edilebilir. Schistosomules yerleşmelerine izin tamamlamak RPMI aşan schistosomules yıkama kuyrukları tarafından kaldırılabilir. Kuyrukları kayan kalacak ve kapalı vakumlu olabilir.
Sağlam cercariae medya varsa, adım 2.5 dönüşüm düzgün idam değildi. Şekil 3b başvuru için sağlam bir cercaria bir görüntü tasvir edilmiştir. Bu sorun oluşursa, kullanılan bulamaç iğne uygun büyüklükte olduğunu sigorta. Ayrıca, cercarial karışımı iğne geçirilir kez, 40 kez genellikle cercarial kuyrukları% 100 kesme yaklaşım çok daha fazla olmasına rağmen, artmış olabilir.
Schistosomules içine cercaria Dönüşümü ilk Colley ve Wikel (13) tarafından 1974 yılında tarif edilmiştir. O zamandan beri, schistosomules hazırlanması, bir iğne ve şırınga ile ya kesme strateji kullanarak Bu çalışmada gösterdiği gibi, bu protokolde tanımlanan veya vorteks bir yaklaşım kullanarak ve Percoll, gradyanlar ile ayrılmış (14, 15) ya da dönen olarak yapılmıştır. Schistosomules hazırlanması için bu iki teknik güzel Fred Lewis (16) ve uzun vadeli büyüme için daha fazla schistosomules kültür için daha fazla bilgi NIAID şiştozom Kaynak Merkezi (bulunabilir tarafından açıklanan www.schisto- resource.org) .
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu proje, E. Jolly sağlanan Case Western Reserve Üniversitesi'nde başlangıç fonları tarafından finanse edildi. Enfekte salyangoz şiştozom Kaynak Merkezi, NIH-NIAID (NIAID Sözleşme No HHSN272201000009I) tarafından verilmiştir. Ayrıca Chris King ve Ronald Blanton enfekte şiştozom salyangoz güvence destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22g x 2-7/8" Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G | |
| RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |
References
- Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M.
- Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).
- Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis. Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).
- King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis. Lancet. 365, 1561-159 (2005).
- Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology. 124, 153-167 (2002).
- Grabe, K., Haas, W. Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration. Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).
- Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni. J Parasitol. 58, 476-480 (1972).
- Saladin, K. S. Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes. J Parasitol. 68, 120-124 (1982).
- Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum. Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).
- Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes. PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing. J Parasitol. 67, 179-185 (1981).
- Yoshino, T. P. &, Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J Parasitol. 81, 714-722 (1995).
- Colley, D. G., Wikel, S. K. Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules. Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).
- Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll. Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).
- Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules. Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).
- Lewis, F.
