Transplante de células precursoras de interneurônios no cérebro de um filhote de camundongo

Resumo

Fonte: Quattrocolo, G., et al. Transplante homocrônico de precursores de interneurônios em cérebros de camundongos pós-natais precoces. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o transplante de células precursoras de interneurônios no cérebro de camundongos neonatais usando uma abordagem homotópica ou heterotópica. O procedimento envolve proteger um filhote receptor anestesiado, identificar a região do cérebro alvo e injetar uma suspensão de células precursoras derivadas de um filhote doador no mesmo estágio de desenvolvimento. Após a injeção, o filhote é transferido para uma almofada de aquecimento para recuperação, permitindo a avaliação subsequente da sobrevivência e maturação das células doadoras.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Remoção do cérebro de camundongo P0-P2

1. Logo antes de iniciar o procedimento, encha várias placas de Petri com sacarose oxigenada gelada e líquido cefalorraquidiano artificial (sACSF). Encha também o(s) tubo(s) de coleta com ~25 mL de sACSF.
2. Embrulhe um filhote do dia 0 a 2 pós-natal (P0-P2) em algum parafilme ou luva e coloque-o bem coberto sob o gelo. Defina um cronômetro para 5 minutos e inicie-o. Após esse tempo, remova o filhote e verifique se ele não responde ao beliscão da pata traseira.
3. Decapite o filhote e colete a cabeça em uma placa de Petri cheia de sACSF. Corte a pele ao longo da linha média para expor o crânio.
4. Localize a abertura no crânio no rombencéfalo / medula espinhal e insira uma extremidade da pinça ao longo da porção dorsal do crânio. Segure suavemente o crânio na linha média e "descasque" os pedaços lateralmente para expor o cérebro, tomando cuidado para não danificar o cérebro.
5. Após a remoção das porções dorsal e lateral do crânio, use a pinça ou a espátula para remover suavemente o cérebro do crânio, escavando por baixo da superfície ventral do cérebro, tentando não danificar nenhuma área. Coloque o cérebro em outra placa de Petri cheia de sACSF carboxigenado. nota: Apresentamos duas estratégias diferentes para dissecar o hipocampo, estriado e córtex. A primeira estratégia (etapas 2.1-2.10) é útil para qualquer linha de camundongo, enquanto a segunda estratégia (etapas 3.1-3.7) precisaria de um camundongo repórter fluorescente para separar claramente o estriado do globo pálido e de outras estruturas cerebrais. Se o estriado não for desejado, ignore as partes específicas do estriado das duas técnicas

2. Harvest Striatum, Hipocampo e Córtex, Técnica # 1

1. Coloque todo o cérebro no molde de matriz de secção, com o lado ventral para cima. Coloque 1 lâmina de barbear na porção mais anterior do cérebro (através do trato olfatório anterior).
2. Insira outra lâmina de barbear logo posterior à primeira para gerar uma fatia de 0,5 mm e coloque uma lâmina de barbear adicional posterior a esta.
3. Transfira essas fatias para uma placa de Petri com sACSF oxigenado e coloque o resto do cérebro em uma placa separada com sACSF. Transfira as fatias estriatais para um escopo de dissecação para visualizar o estriado. Essas fatias devem conter grandes porções do estriado anterior e não ter hipocampo. Use um escopo de dissecação fluorescente com Nkx2.1-Cre^+/-; Ai9^+/- fatias para diferenciar o sinal estriatal fraco do tdTomato do sinal tdTomato forte do globo pálido.
4. Com ou sem fluorescência, retire o estriado de ambos os hemisférios em todas as seções e transfira os pedaços estriados para um tubo de 50 mL devidamente rotulado com sACSF, armazene no gelo.
5. Hemisseccione o cérebro ao longo da linha média usando uma pinça ou uma lâmina de barbear e coloque o hemisfério de forma que a superfície medial fique voltada para cima.
6. Remova o tecido cerebral ventral (tálamo, gânglios da base, etc.) beliscando esse tecido com uma pinça. Quando concluído, o hipocampo (uma estrutura em forma de salsicha que abrange o eixo anteroposterior ao longo do córtex dorsal) e o lado ventricular do córtex devem estar claramente visíveis.
7. Para remover o hipocampo, insira as pontas da pinça na frente do hipocampo anterior e separe suavemente o hipocampo do córtex, movendo a pinça posteriormente e beliscando ao longo da borda hipocampo-cortical. Transfira o hipocampo isolado para um tubo de 50 mL devidamente rotulado com sACSF, armazene no gelo.
8. Para dissecar o córtex, coloque o córtex hemisseccionado com o lado medial voltado para baixo. Em seguida, use a pinça para beliscar as porções mais dorsal, ventral, anterior e posterior do córtex para deixar um pedaço quadrado do córtex somatossensorial medial, ~ 2 mm x 2 mm. Vire o córtex para que o lado medial fique para cima e limpo de qualquer excesso de tecido não cortical (tálamo, gânglios da base, etc.) na superfície medial, se necessário. Transfira o pedaço do córtex para um tubo de 50 mL devidamente rotulado com sACSF e guarde no gelo.
9. Repita o procedimento com o outro hemisfério para coletar as regiões do hipocampo e do córtex.
10. Repita este procedimento para todos os filhotes, certificando-se de substituir o sACSF nas placas de Petri entre os filhotes para garantir que o sACSF permaneça frio e fresco.

3. Colha Estriado, Hipocampo e Córtex, Técnica # 2

1. Coloque o lado ventral do cérebro para baixo em uma placa de Petri revestida com silgard contendo sACSF e prenda-o através do cerebelo e córtex anterior ou bulbos olfatórios.
2. Começando com um hemisfério, use uma pinça curva para separar suavemente o córtex posterior do hipocampo subjacente e de outros tecidos. Coloque delicadamente o córtex descascado na placa de Petri. Repita para o outro hemisfério. O hipocampo e o estriado devem ser claramente visíveis no cérebro exposto.
3. Use uma pinça para beliscar um hipocampo na linha média e descasque o hipocampo lateralmente para removê-lo. Coloque no frasco de coleta no gelo e repita com outro hipocampo.
4. Para o estriado, raspe suavemente as bordas do estriado para soltá-lo do tecido circundante. Em seguida, remova o estriado apertando-o por baixo e adicione-o ao tubo de coleta no gelo. Repita para o outro estriado.
5. As seções corticais podem ser colhidas conforme descrito na etapa 2.8.
6. Se estiver usando uma linha de camundongo repórter transgênico (por exemplo, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), transfira o estriado para uma placa de Petri com sACSF e visualize sob um escopo de dissecação fluorescente. Use uma pinça para remover qualquer tecido não estriatal do estriado (em Nkx2.1-Cre; Camundongos Ai9, removem todo o tecido 'brilhante', pois o globo pálido tem eminência ganglionar medial muito maior ou densidade celular tdTomato + derivada de MGE em comparação com o estriado). Repita para todo o estriado.
7. Repita este procedimento para todos os filhotes, certificando-se de substituir o sACSF nas placas de Petri entre os filhotes para garantir que o sACSF permaneça frio e fresco.

4. Gerando dissociações de células únicas

1. Após a conclusão da dissecção, prepare uma solução de Pronase de 1 mg / mL pesando 10 mg de Pronase e dissolvendo em 10 mL de sACSF carboxigenado.
2. Transfira o tecido dos frascos de coleta de 50 mL para tubos de fundo redondo de 5 mL contendo 2 mL da solução Pronase-sACSF. Incube o tecido por 20 min em temperatura ambiente, agitando/sacudindo o tubo 3-4 vezes com o dedo durante a incubação para misturar as amostras.
3. Durante esta incubação, prepare a solução de reconstituição: soro fetal bovino a 1% (FBS, 100 μL) + DNAse (1 μL de DNAse estoque 1:10.000) em 10 mL de sACSF carboxigenado.
4. Após os 20 minutos, remova cuidadosamente a solução de pronase para não perturbar o tecido na parte inferior e substitua-a por 1-2 mL da solução de reconstituição (o volume total depende da quantidade inicial de tecido).
5. Dissocie mecanicamente o tecido triturando-o com as pipetas Pasteur polidas a fogo previamente preparadas. Começando com a pipeta de grande calibre (~ 600 μm), aspire e expulse a solução de tecido pelo menos dez vezes para quebrar o tecido. Não introduza bolhas na solução. Repita este processo para a pipeta de calibre médio e a pipeta de calibre pequeno. A solução deve ser turva e nenhum pedaço de tecido transparente deve ser visível nos tubos de coleta.
6. Pipetar a solução de lisado celular através de um filtro de 50 μm em tubos cônicos de 5 mL para remover quaisquer aglomerados de células. Prossiga com essas soluções de célula única para citometria de fluxo (ou potencialmente diretamente para contagem de células, se nenhuma classificação for necessária).

5. Preparação de soluções celulares purificadas por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para transplante

1. Ao receber as soluções celulares do citômetro de fluxo, transfira a solução para um (ou vários) tubos cônicos de 1,5 mL e gire as células a 500 g por 5 min a 4^oC. Após a centrifugação, remova o meio para que ~ 20-40 μL permaneçam no tubo. Reconstitua as células neste meio restante (e combine a solução se vários tubos forem necessários).
2. Em um pequeno pedaço de parafilme, misture 2 μL de solução celular + 8 μL de sACSF + 10 μL de coloração azul de tripano. Pipetar 10 μL em um hemocitômetro com tampa de lâmina.
3. Conte o número de células vivas em cada uma das grades quadradas 4 x 4 nos cantos do hemocitômetro usando um contador de contagem manual de laboratório padrão (as células mortas ficarão azuis por causa do corante) e calcule a média dessas 4 contagens. Multiplique esse número por 100 para determinar o número de células por μL.
4. Se necessário, ajuste o volume para que as células fiquem a uma concentração de 10.000-30.000 células/μL em solução de reconstituição. A concentração final depende da quantidade total de células e do número desejado de transplantes. Mantenha as células no gelo para transplante

6. Transplante em filhotes P0-2 WT

1. Enrole um filhote do tipo selvagem (WT) em algum parafilme ou luva e coloque-o bem coberto sob o gelo. Defina um cronômetro para 5 min e inicie-o. Após esse tempo, remova o filhote e verifique se ele não responde ao beliscão da pata traseira.
2. Enquanto o filhote estiver no gelo, misture a solução celular pipetando-a várias vezes para garantir que a suspensão celular esteja bem misturada antes do carregamento (misture as células antes de carregar a micropipeta para cada injeção). Em seguida, esvazie a micropipeta do óleo mineral e encha-a completamente com a suspensão celular.
3. Coloque o filhote anestesiado na placa de Petri com a cabeça apoiada na massa adesiva de modo que o topo da cabeça fique relativamente plano. Coloque a fita com o orifício de diamante na cabeça do filhote, puxando-a esticada para garantir que a pele esteja esticada e a cabeça firme, mas que o rato esteja confortável e respirando bem. Lambda deve ser visível através do orifício de diamante.
4. Mova o filhote preso sob o Nanoject e abaixe a micropipeta de modo que a ponta da micropipeta fique diretamente acima do lambda. Registre as coordenadas x-y no manipulador.
5. Ajuste os botões do manipulador para mover a micropipeta para as coordenadas desejadas ao longo do eixo mediolateral e ântero-posterior da cabeça: córtex somatossensorial primário ou córtex S1 → 1,0 mm anterior e 1,0 mm lateral, hipocampo → 0,75-1,0 mm anterior e 1,0-1,2 mm lateral, estriado → 2,0-2,2 mm anterior e 1,5 mm lateral. As coordenadas podem ser ligeiramente ajustadas para compensar a idade do filhote (por exemplo, P0 vs. P2) ou a linhagem de camundongos (por exemplo, camundongos CD1 são maiores que e C57/B6 em P2).
6. Abaixe a micropipeta até formar uma pequena concavidade na pele. Em seguida, gire o botão do manipulador do eixo z com firmeza, mas com cuidado, para conduzir a micropipeta através da pele e do crânio para entrar no cérebro. Quando a micropipeta entra no cérebro, a pressão no crânio é liberada e a concavidade desaparece.
7. Retraia ligeiramente a micropipeta até que a ponta esteja rodeada por um cone de pele, em forma de tenda. Leia as coordenadas ao longo dos eixos z: Este será o ponto zero do eixo z.
8. Abaixe a micropipeta até a profundidade desejada: Córtex → 0,75-1,0 mm, Hipocampo → 1,2-1,5 mm, Estriado → 2,0-2,5 mm. A profundidade pode ser ligeiramente ajustada para compensar a idade ou tensão do filhote.
9. Injete a suspensão celular usando o programa Nanoject III descrito acima. Após a conclusão do programa de injeção, aguarde 15-20 s antes de retrair lentamente a micropipeta para minimizar o vazamento da solução para fora do local da injeção.
10. Se estiver realizando injeções bilaterais, zere novamente a micropipeta acima lambda e mova-se para as coordenadas adequadas no outro hemisfério. Alternativamente, pode-se fazer duas injeções no córtex do mesmo hemisfério movendo a micropipeta 1 mm antes da primeira injeção.
11. Quando o transplante estiver concluído, remova a fita e transfira o filhote para a almofada de aquecimento. Se necessário, marque o filhote pelo corte da cauda ou do dedo do pé. Assim que o filhote readquirir a cor vermelha e estiver se movendo, coloque-o de volta na gaiola com a mãe.

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