Transfecção mediada por eletroporação de gânglios da raiz dorsal de camundongos para promover a regeneração sensorial do axônio

Resumo

Fonte: Li, Q. et al. Investigando a regeneração do axônio de mamíferos: eletroporação in vivo do gânglio da raiz dorsal de camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a transfecção mediada por eletroporação de neurônios DRG de camundongos para estudar a regeneração do axônio. Ele descreve as etapas para fornecer construções de ácido nucleico aos neurônios DRG, induzir lesão do nervo ciático e avaliar a regeneração axonal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeção do gânglio da raiz dorsal (DRG)
   1. Injete uma solução anestésica (avertin diluído em solução salina estéril na concentração final de 20 mg/mL, com avertin 200 mg/kg de peso corporal) por via intraperitoneal para manter a anestesia antes da injeção de DRG.
   2. Carregue os plasmídeos de ácido desoxirribonucléico (DNA) ou oligos de ácido ribonucléico (RNA) (1 μL por DRG) na pipeta capilar de vidro.
   3. Insira a ponta da pipeta de vidro capilar cuidadosamente no DRG.
   4. Injete gradualmente 1,0 μL de solução de plasmídeos de DNA ou oligos de RNA no DRG usando os sistemas de distribuição de microinjeção intracelular (30 psi, 8 ms).
      NOTA: A duração da injeção não deve durar menos de 5 minutos.
2. Electroporation
   1. Colocar solução salina tamponada com fosfato (PBS) nas pontas dos eletrodos.
   2. Limpe o sangramento com gaze de algodão quadrada esterilizada.
   3. Aperte suavemente o DRG alvo com os eletrodos e aplique 5 pulsos elétricos quadrados com o sistema de eletroporação.
   4. Feche as camadas muscular e cutânea com suturas de nylon 5-0, respectivamente.
   5. Coloque o camundongo em um cobertor aquecido (35,0 ° C) sob muita atenção até que ele tenha recuperado completamente a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Retorne o mouse para a gaiola inicial depois que ele estiver totalmente recuperado da anestesia.
      NOTA: Leva aproximadamente 60 minutos para o mouse se recuperar completamente da anestesia no cobertor a 37 °C. Dissolva uma pílula (200 mg) de ibuprofeno em 1.000 ml de água (0,2 mg/ml) para alimentação diária para aliviar a dor pós-cirúrgica.
3. Crush do nervo ciático
   1. Dois ou três dias (dependendo do desenho experimental) após a eletroporação do DRG, anestesiar o camundongo por via intraperitoneal com a solução anestésica (com avertin 400 mg/kg de peso corporal).
   2. Cole os quatro membros do rato no quadro de cortiça.
   3. Faça uma incisão de 1 cm 0,5 cm para o lado esquerdo ao longo da linha média. Corte os músculos, como o músculo glúteo máximo e o músculo piriforme, longitudinalmente. Exponha o segmento do nervo ciático entre o forame isquiático maior e a incisura ciática.
   4. Esmague o nervo com uma pinça de microcirurgia por 12 s e marque o local do esmagamento com uma sutura epineural de náilon 10-0. Faça um nó na membrana dural para marcar o local do esmagamento.
   5. Feche as camadas muscular e cutânea com sutura de nylon 5-0.
   6. Coloque o rato sobre uma manta aquecida (35,0 °C) com muita atenção até que tenha recuperado completamente a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Retorne o mouse para a gaiola inicial depois que ele estiver totalmente recuperado da anestesia.
      NOTA: Leva aproximadamente 60 minutos para o mouse se recuperar completamente da anestesia no cobertor de 37 °C. Dissolva uma pílula (200 mg) de ibuprofeno em 1.000 ml de água (0,2 mg/ml) para alimentação diária para aliviar a dor pós-cirúrgica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ECM 830 Sistema de eletroporação de onda quadrada	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Para eletroporação in vivo
Eletrodos de pinça	BTX Harvard Apparatus	45-0524	Para eletroporação in vivo, 1 mm plano
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Sistemas de Distribuição de Microinjeção Intracelular
Capilares de Vidro de Borosilicato	World Precision Instruments, Inc.
Microscópio de Dissecção Estéreo	Leica	M80
Pinça de Microcirurgia	FST da DUMONT, Suíça	11255-20	Apenas para esmagamento do nervo ciático
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, fita de parede padrão
	Fisherbrand	15-901-30	Para fixar o mouse no quadro de cortiça
2, 2, 2-Tribromoetanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Solução estoque Avertin
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Solução estoque Avertin
siRNA Controle Negativo Universal Fluorescente #1	Sigma-Aldrich	SIC003	SiRNA não-alvo com
microRNA de fluorescência Controle de transfecção mímica com Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	MicroRNA não-alvo com kit
preparação de plasmídeos	Invitrogen Purelink	K210016	Preparação de plasmídeo codificador de GFP
Corante Verde Rápido	Millipore-Sigma	F7252	Para melhor visualização do contorno do DRG durante a injeção
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Indução anestésica
Xilazina	AnaSed	NDC 59399-110-20	Indução anestésica
Paracetamol	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Alívio da dor pós-cirúrgica

1902328 de de fluorescência