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1. Cultura neuronal
- Trate as placas de cultura de 6 poços com lamínulas de vidro com poliornitina (diluída a 1/6 em solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco, concentração de estoque de 0,01%) durante a noite (O/N), seguidas de três lavagens em DPBS. Em seguida, adicione laminina (concentração de estoque de 1 mg / ml, diluída 500 vezes em DPBS) por pelo menos 10 horas sob a coifa.
- Plaquear e despachar células-tronco neurais (NSC) em baixa densidade (50.000 células/cm2) em placas de cultura de 6 poços com lamínulas de vidro em 3 ml de meio de cultura consistindo em Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 ou DMEM/F12 (500 ml), 2 frascos (5 ml cada) de suplemento N2, 2 frascos (10 ml cada) de suplemento B27, 10 ml de Pen-Estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades/ml e Estreptomicina = 10.000 unidades/ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (solução estoque: 50 mM) e laminina (1/500), sem fatores de crescimento.
ETAPA CRÍTICA: Execute esta etapa com cuidado, adicionando células com movimentos de rotação lenta para reduzir o agrupamento celular. - Remova o meio de cultura. Adicionar meio N2B27 fresco contendo 2 μg/ml de solução fresca de laminina para manter o neurónio ligado às lamínulas de vidro e evitar aglomeração. Troque o meio a cada 3 dias. Conservar um pouco do meio restante (200 μl) antes de adicionar meio fresco para evitar que a célula seque. Em alternativa, proceda rapidamente e altere o volume total (3 ml).
2. Transdução Lentiviral
Nota: A expressão da Proteína Fluorescente Verde (GFP) é impulsionada pelo promotor da fosfoglicerato quinase (PGK) de camundongo. Para este estudo, o título viral foi de 400 ng/μl (solução estoque em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x).
- Transduzir células estaminais pluripotentes induzidas por seres humanos ou neurónios derivados de iPSC em qualquer fase da maturação por partículas virais, adicionando 1 μl da solução-mãe contendo 40 ng de vetor lentiviral GFP por poço de cultura (placas de 6 poços) e incubar durante 48 horas em meio de cultura fresco. Nota: Para este protocolo, a duração da incubação permite uma boa rotulagem das estruturas da coluna.
3. Imunofluorescência
Nota: A fim de melhorar a marcação de toda a morfologia da coluna, a marcação por imunofluorescência foi realizada usando um anticorpo anti-GFP em condições permeabilizadas.
- Remova o meio de cultura e fixe as células transduzidas em lamínulas em paraformaldeído a 4% por 10 min em temperatura ambiente ou RT, depois lave 3 vezes em 1x PBS (10 min cada).
- Mergulhe as lamínulas em PBS suplementadas com 0,05% de Triton (100x) e 10% de soro de cavalo por 1 hora em RT e, em seguida, lave 3 vezes em 1x PBS.
- Adicione 100 μl de 1x PBS suplementado com 4% de soro de cavalo e anticorpo primário (1/1.000) aumentado contra GFP e diluído por um fator de 1.000 em cada lamínula. Incube em uma caixa escura O/N a 4°C e depois lave 3 vezes com 1x PBS.
- Dilua o anticorpo conjugado com Alexa Fluor 488 (1/200) em PBS suplementado com 0,5% de Tween 20 e incube por 1 hora em RT. Em seguida, lave 3 vezes em 1x PBS e monte lamínulas em lâminas de vidro com um meio de montagem para microscopia de fluorescência.
4. Imagem da coluna dendrítica
- Realize imagens confocais através de um microscópio confocal de varredura a laser.
- Selecione neurônios saudáveis com morfologia piramidal e uma arborização dendrítica completa e quantifique pelo menos 10 neurônios por condição a partir de experimentos separados. Quantificar 60 - 100 μm por dendrito.
- Adquira imagens usando uma objetiva de óleo 40X NA = 1,3 e uma linha de laser de 488 nm para excitação GFP, com uma potência de pico típica no nível da amostra em torno de 20 μW. Defina o tamanho do pixel em torno de 80 nm para amostrar adequadamente os espinhos dendríticos.
Nota: A análise subsequente exige uma imagem na qual o ruído não comprometa a segmentação adequada de dendritos e espinhos. Com as configurações de amostragem espacial e energia mencionadas acima, observamos que um tempo de permanência de pixel de 3,15 μs é suficiente para coletar fótons suficientes para construir tal imagem. Para amostras escuras, a qualidade da imagem pode ser melhorada com uma média de 2 a 4 varreduras. A aquisição de vários ladrilhos XY pode ser necessária para cobrir a região de interesse, que deve ser costurada antes do processamento. - Para amostrar todo o volume do neurônio, adquira uma pilha Z com espaçamento Z variando de 150 nm a 300 nm, produzindo 20 a 30 fatias Z.
Nota: A resolução espacial lateral alcançada com essas configurações é de 234 nm e a resolução axial é de 591 nm. A amostragem escolhida aqui é adequada, mas como a resolução axial é maior do que o menor tamanho dos espinhos a serem visualizados, a análise favorece os espinhos que se estendem lateralmente a partir dos dendritos.
5. 3D Quantificação de Espinhas Dendríticas
Nota: As seções a seguir descrevem especificamente o uso do software Imaris para análise. Existem implementações alternativas, incluindo NeuronStudio ou Metamorph, que podem fornecer resultados semelhantes.
Use as seguintes configurações principais:
- Como um estágio de pré-processamento, a filtragem gaussiana é usada por meio dos recursos de processamento de imagem oferecidos pelo software. Execute a filtragem gaussiana por meio do Processamento > Suavização de imagem > Filtro gaussiano. Defina a largura do filtro para ser igual ao tamanho do pixel em XY.
- Execute um rastreamento semiautomático de dendritos usando o módulo Filament Tracer do software.
- Primeiro, estime o diâmetro do dendrito usando a ferramenta de distância na guia Slice do software.
- Na guia Passar, clique na ferramenta Filamentos. Para uma melhor robustez, este protocolo conta com rastreamento semi-automatizado; clique em Ignorar criação automática. A interface do módulo agora está mostrando a guia Desenhar. Aqui, selecione AutoPath como um método, Dendrite como um tipo e insira o diâmetro estimado do dendrito.
- Use o modo Selecionar do ponteiro, transformando o cursor em uma caixa. Clique com a tecla Shift pressionada no ponto inicial do dendrito. Nota: O software realiza cálculos iniciais.
- Mova o ponteiro ao longo do dendrito. A partir do ponto de partida (representado como uma esfera azul), uma linha amarela representando o caminho dendrito mais provável é mostrada. Clique com a tecla Shift pressionada no ponto final do dendrito.
- Execute a segmentação automatizada de spines. Nota: Os espinhos no dendrito traçado devem ser encontrados automaticamente pela interface do módulo.
- Na interface do módulo, clique na guia Criação. Na lista suspensa Reconstruir, escolha Reconstruir Diâmetro do Dendrito e marque a caixa Manter dados. Em seguida, clique em Reconstruir.
- Defina o Limite para que o volume segmentado corresponda ao volume real do dendrito. Como um algoritmo, selecione a distância mais curta no mapa de distância. Clique no botão Avançar.
- Determine o menor diâmetro da cabeça da coluna e o comprimento máximo, novamente usando a ferramenta de distância na guia Fatiar do software, depois volte para a guia Superar e insira os parâmetros. Para este protocolo, valores em torno de 200 - 300 nm para diâmetro mínimo e 4 μm para comprimento máximo são bons pontos de partida. Não marque a caixa Permitir Spines de Ramos. Clique no botão Avançar.
- Ajuste o Limite de pontos iniciais para que os pontos azuis que representam os espinhos sejam localizados nas cabeças reais dos lombados. Clique no botão Avançar. Nota: O cálculo principal é feito agora e pode ser demorado.
- Classifique os spines acessando a guia Ferramentas da interface do módulo. Clique em Classificar Espinhos. Na interface do usuário solicitada, certifique-se de que haja quatro classes, definidas por sua morfologia da seguinte forma: Stubby: comprimento <1 μm; Cogumelo: Comprimento (lombada) >3 e largura máxima (cabeça) >largura média (pescoço) x 2; Longo fino: Largura média (cabeça) ≥ Largura média (pescoço); Filopódio: Comprimento ≤ 4 μm (sem cabeça). Nota: A interface do módulo gera quatro novos objetos Filament contendo os resultados da classificação.
- Exportar dados estatísticos: em qualquer uma dessas quatro interfaces de objetos, vá para a guia Estatísticas. Clique no botão Exportar todas as estatísticas para o arquivo.
Nota: Outros valores estatísticos podem ser exportados para dendritos (por exemplo, comprimento, área, diâmetro médio, profundidade do ramo, ângulo de ramificação, volume, etc.) e espinhos (por exemplo, retidão, área de fixação, comprimento e volume de partes distintas da coluna, diâmetro da coluna, densidades, etc.).