Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Resumo

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de solução estoque de cloridrato de lidocaína a 20%

1. Pese 2 g de cloridrato de lidocaína. Adicione 5-6 mL de água estéril e vortex suavemente. Aumente o volume para 10 mL com água estéril.
2. 1.2 Filtre a solução estoque através de filtros de 0,2 mícron. Alicotar a solução de reserva, 1 mL por tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, e selá-la com uma película de vedação. Conservar a 4 °C.

2. Entrega intratecal direta de AAV em camundongos acordados

1. Limpe a área de trabalho usando gaze estéril com etanol a 70% e prepare os suprimentos necessários.
2. Prepare 100 μL de complexo de cloridrato de lidocaína AAVrh.10/1% adicionando 95 μL de solução estoque de rAAVrh10 (5 x 10¹² cópias do genoma / mL) em um tubo de microcentrífuga estéril de 200 μL e adicione 5 μL de solução estoque de cloridrato de lidocaína a 20%. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Em seguida, armazene a solução do vírus em gelo (4 °C).
   NOTA: Serão usados 8 μL por camundongo.
3. Preparar a seringa com solução injetável de AAV
   1. Esterilize a área de trabalho em um exaustor com etanol 70%. Coloque o rato acordado (macho ou fêmea, 30 a 70 dias de idade, 13 a 20 g de peso) em uma peça de cama em decúbito ventral no capô. Cubra a parte superior do corpo com gaze estéril para acalmar o rato e evitar ser mordido.
   2. Fixe o animal segurando adequadamente e firmemente sua cintura pélvica com o polegar de um lado e o indicador/dedo médio do outro lado. Mantenha a pele entre as cinturas pélvicas bilaterais esticada com o polegar e o indicador. Segure suavemente a parte superior do corpo do animal com a palma da mão.
   3. Raspe o pelo das costas entre as cinturas pélvicas bilaterais e, em seguida, esterilize a superfície da pele com uma esfoliação à base de iodeto e etanol a 70%.
4. Injeção intratecal
   1. Sinta o espaço intervertebral ao longo da linha média entre as cinturas pélvicas bilaterais com o polegar ou indicador da outra mão e pressione um recuo com a unha para indicar o espaço intervertebral L5-L6 (localize o local da injeção).
   2. Gire a base da cauda levemente e suavemente para indicar a linha média da coluna. Ajuste o bisel da agulha em direção à cabeça do animal antes da injeção.
   3. Certifique-se de que os animais estejam firmemente fixados e alinhe a agulha ao longo da linha média da coluna.
   4. Insira a agulha suavemente e verticalmente (ou incline ligeiramente 70–80°) na interseção do recuo, mantendo a seringa em um plano sagital central. Reduza lentamente o ângulo para aproximadamente 30° quando ele conectar o osso e, em seguida, deslize a agulha para o espaço intervertebral.
      NOTA: Um movimento repentino evidente da cauda é um sinal de entrada bem-sucedida no espaço intradural. Assim que a agulha entrar no espaço intervertebral, a ponta da agulha ficará firmemente presa. A agulha 27 G usada neste estudo é adequada para entrega de TI em camundongos, mas não em ratos.
   5. Injectar a solução vectorial. Inicie o temporizador e injete 8 μL da solução vetorial a uma velocidade de 1 μL / 4 s. Guarde a agulha aproximadamente 1 minuto após terminar o parto. Retire a agulha com rotação suave para evitar vazamentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
FVB/NJ camundongos	Charles River Laboratories China
Cloridrato de lidocaína monohidratado	HEOWNS	73-78-9
AAV	Núcleo de vetor viral do Centro de Terapia Gênica da Universidade de Escola
25μL Seringa Hamilton / agulha 27-30g	GASTIGHT	1702
70% Etanol	WEN ZHI
Gaze	Wei AN	5171112	8cm * 10cm * 12cm

de Medicina de Massachusetts