Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Summary

Um método para preparar traducionalmente ativa, synaptoneurosomes intacta (SNs) de córtex cerebral de rato é descrito. O método utiliza um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose permitindo a preparação rápida de ativos SNs.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) são obtidos após homogeneização e fracionamento de rato córtex cerebral. Eles são selados vesículas ou terminais isolados que romper com os terminais do axônio quando o tecido cortical é homogeneizado. Os SNs reter características pré e pós-sináptico, o que os torna útil no estudo da transmissão sináptica. Conservem as máquinas moleculares utilizados na sinalização neuronal e são capazes de captação, armazenamento e liberação de neurotransmissores.

A produção e isolamento de ativos SNs pode ser problemático mídias usando como Ficoll, que podem ser citotóxicos e centrifugação prolongada devido a alta densidade, e filtração e métodos de centrifugação, que pode resultar em baixa atividade, devido a danos mecânicos do SNS. No entanto, o uso de gradientes descontínuos de Percoll-sacarose de densidade para isolar SNs fornece um método rápido para produzir bons rendimentos de SNs traducionalmente ativo. O método do gradiente Percoll-sacarose é rápido e gentil como ele emprega condições isotônica, tem spins centrifugação menos e mais curtos e evita que as etapas de centrifugação pellet SNs e causar danos mecânicos.

Protocol

1. Preparações ^1-4

1. Prepare 500 mL de tampão de meio de gradiente (GM), misturando 50 mL de uma pasta de sacarose 2,5 M, 2,5 mL de uma 1M Tris-HCl, pH 7,5 valores, e 0,1 mL de um 0,5 m EDTA, pH 8,0 estoque com mili- Q água para volume. Filtro de esterilizar a solução de alíquota, e armazenar congelados.
2. Prepare um estoque de 1000x tetrodotoxina (TTX) fazendo uma solução de 1 mM em mili-Q H ₂ O. Alíquotas de TTX podem ser armazenadas a -20 ° C.
3. Preparar o tampão de Estimulação 10x, fazendo uma solução de 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na ₂ HPO _{4, 4} mM KH ₂ PO _4, 40 mM NaHCO _3, e 800 mM NaCl em água milli-Q. Estoque pode ser armazenado a 4 ° C.
4. Pré-cool centrífugas a 4 ° C.
5. Prepare uma solução estoque de Percoll isosmótica (SIP), adicionando 9 volumes de Percoll (18 mL) para 1 volume de 2,5 M de sacarose (2 mL) em água milli-Q e misture bem.
6. Preparar a 3, 10, 15, e camadas gradiente de 23%, adicionando os respectivos montantes de SIP para a GM de buffer e cada mistura:

7. Despeje camadas gradiente por pipetagem de 2 ml cada um dos 23, 15, 10, e 3% em soluções de Percoll isosmótica os tubos de centrifugação Beckman com tampas usando um P1000 Gilson Pipetman. A interface entre as camadas devem ser claramente distinguíveis, sem mistura das camadas. Armazenar os gradientes de temperatura de 4 ° C durante pelo menos 20 min antes do uso. Os gradientes podem ser armazenadas por até 24 horas, embora use mesmo dia é recomendado. [Pessoal de laboratório inexperientes podem praticar gradientes preparando adicionando corante azul para as soluções isomotic Percoll para a visualização das interfaces da camada.]

2. Dissecção do mouse ^uma

1. Garantir que todos os criação de mouse e eutanásia procedimentos são realizados de acordo com as diretrizes do NIH e da Universidade. Euthanize filhotes (idade P13 a P21) por asfixia dióxido de carbono ou por um método aprovado no protocolo animal.
2. Pin o mouse para uma placa de dissecção e pulverizar a parte de trás do pescoço e da cabeça com etanol. Usando uma tesoura afiada corte através da medula espinhal na base do crânio, retire a pele da parte superior do crânio, corte no crânio lateralmente entre o osso eo osso parietal interparietal ou entre o cérebro e as regiões do córtex. Em seguida, corte no crânio da base para o nariz (ao longo da sutura sagital), remova cuidadosamente o osso parietal macia puxando cada hemisfério para o lado e remover o córtex com uma espátula. Inserir a espátula no cérebro acima do cerebelo e, em seguida, retire o córtex e colocá-lo na gelada tampão GM. Proceder de imediato para a etapa de homogeneização. Não deixe que os córtices sentar na gelada tampão por muito tempo como este irá afectar negativamente a formação de SNs.

3. Preparação de homogenato e SNs ^04/01

1. Enxágüe os córtices no gelada tampão GM e transferência de dois córtices para um homogeneizador de vidro Dounce contendo 5 mL de tampão GM frio.
2. Homogeneizados suavemente os córtices com golpes 10/05 do pilão solto (pilão "A"), seguido por acidentes vasculares cerebrais 10/05 do pilão apertado (pilão "B"). Strokes deve ser rápido, mas lento o suficiente para não causar bolhas de ar. A imagem do homogenato após homogeneização está no Esquema 1. O número de acidentes vasculares cerebrais irá variar consoante a homogeneizador individuais e pilões de acompanhamento. Quando terminar os gradientes deve dar uma banda SN forte, se não, ajustar o número de acidentes vasculares cerebrais.
3. Transferir o homogeneizado para a 15 mL cônica e centrifugar a 1000xg por 10 min a 4 ° C em um rotor de caçamba móvel (Allegra 6KR centrífuga) para pellet restos celulares e núcleos. A Imagem do homogeneizado é girado no Esquema 1.
4. Layer 2 mL do sobrenadante por Percoll-sacarose gradiente de tampão, os tubos, e centrifugar a 32.500 xg por 5 min a 4 ° C em um rotor de ângulo fixo (Beckman J2-21 centrífuga, JA-17 rotor) o uso de adaptadores apropriados ( ver Reagentes e Equipamentos Tabela).
5. Pipeta e descartar a solução acima da banda SN usando um copo Pasteur pipeta. Pipeta off da banda SN na interface 15/23%, transferir para um cone e armazenar no gelo. Cada gradiente ou um córtex produzirá 0,9-1,1 mL de SN.
6. Ajustar a concentração de sal do SNS, adicionando um décimo volume de tampão de estimulação 10x, adicione CaCl 1000x ₂ a uma concentração final de 12 nM, e adicionar 1 mM de ações TTX a uma concentração final de 1 mM para suprimir a excitação inespecífica. (Adição de CaCl ₂ é opcional se ele vai interferir com aplicações a jusante SN).
7. Determinar a concentração de proteína do SNs usando o Micro BCA Protein Assay Kit. (O teste de proteína Bradford não é recomendado porque de inferência do Percoll.)
8. SNs podem ser usados ​​diretamente e rapidamente para a proteína traduçãoção estudos. Para outras aplicações SN lisado podem ser limpos ou concentrado com o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep.

4. Resultados representativos:

Quando o mouse córtex foi homogeneizado e separados em descontínuo de Percoll-sacarose gradientes (Esquema 1), 6 bandas ou frações foram (Figura 1). Foi mostrado anteriormente para o córtex cerebral de ratos ^3,5 que os componentes da alta bandas de peso molecular foram quebrados e membrana de mielina e que o material continha mitocôndrias peletizada ou organelas (Tabela 1). Os 23% interface / 15% (faixa 5) continha os SNs enriquecido.

A banda na interface de 23% / 15%, contendo SNs intacta, foi retirado e examinado por microscopia eletrônica (EM) conforme descrito anteriormente. ^2,6 EM mostrou a presença de vesículas sinápticas intacta ea preservação de elementos pré-sináptico e pós-sinápticos (Figura 2). Isolamento de compartimentos pré e pós-sináptica é importante para o exame de sinalização e de síntese de proteína, que ocorre em ambos os compartimentos. ^7-13 O gradiente de Percoll-sacarose é um purificação bruto então vimos menor contaminação, celular organela nuclear e na fração de SN, mas o separação geral foi bom.

Quando examinados por Western Blot, as frações Percoll continha os marcadores de proteína com um aumento esperado na pureza sináptica na banda SN (Figura 3, Tabela 2). Marcadores sináptica e neuronal foram mantidos na faixa de SN enriquecido (faixa 5), ​​mas a abundância de outros marcadores foi significativamente reduzida. Em particular, a presença de GFAP, um marcador de células neoplásicas e astrócitos de origem glial, e Lamin-B1, um marcador nuclear, foram insignificantes, enquanto marcadores estruturais e sinápticas foram mantidos ou melhorados. Além disso, houve retenção de marcadores de organelas, como as mitocôndrias e Golgi, que desempenham um papel na síntese protéica.

Rendimentos típicos para a banda SN foram 250-500 ng de proteína por mL, conforme determinado pelo BCA ensaio de proteína. A atividade do SNS foi determinada pela quantidade de síntese protéica de novo presente como monitorados por [35S]-Met incorporação (Figura 4). Basal ² atividade translacional aumentou 1,56 vezes quando SNs foram estimulados com 50 mM mM glicina glutamate/10 (Glu), ou 5,12 vezes quando ativada com o inibidor juglone Pin1. Inibição Pin1 é conhecido por resultar em aumento da síntese protéica. ² Para confirmar que o aumento do [35S]-Met incorporação era devido a síntese de proteínas de novo, nós adicionamos 40 anisomicina mM, um inibidor da síntese de proteínas, e viu uma acentuada diminuição na incorporação na presença e ausência de Glu, quando comparado aos níveis basais. Também, mediante a adição de 2% Triton-X 100, o que perturba a integridade dos SNs, tradução basal foi reduzida em 75%. ² Além disso, ao examinar as bandas (B4-B6), que mostrou o enriquecimento marcador mais sináptica, O SNS ou Banda 5 teve a maior atividade de síntese protéica de novo (Figura 5). Assim, o descontínuo de Percoll-sacarose gradientes rapidamente produzir um altamente ativa e enriquecido banda SN que pode ser usado para estudar a tradução proteica.

O procedimento de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose é mais vantajoso do que outros métodos, porque dano mecânico é causado pelas condições mais duras. Quando comparado com o método de filtração, em que apurou homogeneizado cortical é passado através de uma série de filtros que diminuem em tamanho, ^3,14-15 o método Percoll formas SNs mais com maior atividade. Como visto na Figura 6, quando uma alíquota de SNs preparados pelo método de filtração foi passada ao longo de um gradiente de Percoll-sacarose há SNs muito menos na interface 15/23% e uma maior quantidade de membranas quebrado. Quando de novo a síntese de proteínas foi medida através S35 met-incorporação, o SNS preparado pelo método de filtração eram muito menos ativa (Figura 7). Para maximizar a atividade translacional usamos ratos que estão entre a idade P14 e P18. SN pode ser preparado a partir de camundongos adultos, mas observamos um aumento significativo de atividade translacional com SN preparados a partir de ratinhos jovens (Figura 8).

Tabela 1. Constituintes das bandas do Percoll descontínuo gradiente de fracionamento do córtex do rato homogeneizado. ^3,5

Tabela 2. Resumo da análise de parafuso ocidental de Percoll descontínuo de sacarose-constituintes banda degradê. Concentrações de proteína relativa para cada uma das frações isoladas banda usando um Percol descontínual de sacarose-gradiente foi determinada por Western Blot. Sem proteína presente (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), ou> 0,8 vezes (+++) = maior proteína presente no sobrenadante representante (S, centrifugado córtex homogenato), de n 3.

Esquema 1: Esquema de uma preparação SN utilizando um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose córtex cerebral de camundongos foram dissecados, homogeneizado, e centrifugação a baixa velocidade para remover não-homogeneizado de tecido, células, organelas todo, como núcleos e membranas.. O gradiente descontínuo deve ter camadas bem definidas. A imagem mostra um exemplo de inserção das camadas, que têm sido tingido de azul apenas para fins ilustrativos, a fim de visualizar as camadas. O sobrenadante é camadas em cima de um gradiente de Percoll-sacarose descontínuo e centrifugado a velocidade média. A banda SN é então recuperado do gradiente e está pronto para usar.

Figura 1. Fracionamento homogeneizado em um gradiente Percoll-sacarose descontínua. Córtex do rato foi homogeneizado e separados em um gradiente Percoll-sacarose descontínua dando origem a 6 bandas ou frações. A purificada, ativa SNs (*) foram encontrados na faixa 5.

Figura 2. Preparações SN dar uma mistura heterogênea de SNs que retêm elementos pré-sináptico e pós-sináptica. Uma micrografia eletrônica de uma preparação SN preparados a partir de camundongos C57BL / 6 (idade P13 a P21) foi realizada como descrito anteriormente SNs e shows com preservados elementos pré-sináptico e pós-sináptica. ^{2 , 6} pontos setas vermelhas para pós-sinápticos densidades. Barra de escala é 1 mícron.

Figura 3. Análises de Western blot de preparações SN mostraram que os marcadores sináptica e neuronal foram mantidas no SNs purificada (Band 5), mas a abundância de outros marcadores foi significativamente reduzida. Immunoblots do sobrenadante (S, centrifugado homogeneizado cortical) e Bandas 1-6 de uma descontínua Percoll-sacarose gradiente foram sondados para β-actina (controle, estruturais de carga), GFAP (astrocitária), GP73 (Golgi), HSC70 (citoplasmática e nuclear), Lamin-B1 (nuclear), Prohibitin (mitocondrial), PSD95 (densidade pós-sináptica ), SNAP25 (sináptica), sinaptofisina (synaptic) e β3-tubulina (neurônio-específica). As bandas foram visualizadas utilizando uma tempestade 860 Phosphorimager, representante de n = 3.

Figura 4. SNs são ativos e apresentam a síntese de proteínas de novo através de [35S]-Met incorporação. SNs foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Em seguida, o SNs foram pré-tratados ou não tratada por 15 min com 40 mM anisomicina ou 1 mM juglone a 37 ° C seguido por adição de [35S]-Met, 20 l expresso Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM.

Figura 5. Banda de 5 a partir do gradiente de Percoll-sacarose descontínua continha os mais altos níveis de síntese protéica de novo. Bandas 4, 5 e 6 e do sobrenadante (S, centrifugado homogeneizado cortical) foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Então, [35S]-Met, expresso Mix Etiqueta Pro S35 Tag Fácil, foi adicionado, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM.

Figura 6. SNs preparados a partir de um método de filtração contêm membranas mais quebrado e SNs menos do que toda SNs preparado a partir do método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose. SNs foram preparadas pela passagem de córtex homogeneizada através de uma série de filtros com a diminuição da dimensão dos poros, como descrito anteriormente. ^3,14-15 alíquota Um dos SNs preparados pelo método de filtração foi centrifugado em um gradiente de Percoll-sacarose descontínuo e em comparação com um montante equivalente de material usando o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose.

Figura 7. SNs preparados a partir de um método de filtragem de novo contêm menos proteínas do que atividade de síntese SNs preparado from o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose. SNs foram preparadas pela passagem de córtex homogeneizada através de uma série de filtros com a diminuição da dimensão dos poros, como descrito anteriormente, ^3,14-15 e pelos métodos Percoll descontínuo de sacarose-gradiente. SNs de ambas as preparações foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Então, [35S]-Met, expresso Mix Etiqueta Pro S35 Tag Fácil, foi adicionado, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM.

Figura 8. SNs de ratos jovens (P14) têm maior atividade translacional do que os camundongos mais velhos (P85). SNs foram preparados a partir de diferentes ratos idosos usando o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose, preequilibrated a 37 ° C por 10 min, tratada ou não com Glu na presença de [35S]-Met (Express Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil) por 30 min, snap congelados, e depois limpou com o Kit Prep Pierce SDS-PAGE da amostra. Os SNs foram executados em um 12% de gel de poliacrilamida SDS, secas e fotografada em uma tempestade Molecular Dynamics 860 phosphorimager representante do n = 3, ± SEM. SNs de P14 camundongos foram pelo menos 3 vezes mais ativo do que P85 camundongos.

Discussion

A preparação de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose aqui descrito é um método rápido e confiável para isolar SNs ativo, que pode ser usado em uma variedade de experimentos de transmissão sináptica. Este método do gradiente, que é baseado no método desenvolvido por Dunkley et al., ^3,4 é um procedimento de fracionamento subcelular cérebro que isola pré e pós-sináptica da membrana derivada vesículas que estão associados com o outro. Sem purificação adicional esses SNs são compatíveis com uma variedade de t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Micro BCA Protein Assay Kit	Perfurar	23235
CaCl 2	Pescador	C79-500
Gás CO2	Airgas (UW-MDS)	CD 50
EDTA	RPI	E57020
EtOH	Pescador	A407SK-4
HCl	Pescador	A142-212
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
KH 2 PO 4	Pescador	P285-500
PierceSDS PAGE-Sample Prep Kit	Perfurar	89888
NaCl	RPI	S23020
NaHCO 3	Pescador	BP328-500
Na 2 PHO 4	Pescador	S381-500
Sacarose	RPI	S24060
Tris Base de Dados	RPI	T60040
Tetrodotoxina	Sigma	T5651
Expressar Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil	Perkin Elmer	NEG772
Equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Ferramentas de dissecção
Dounce homogeneizador, 7 mL (vem com dois pilões de vidro "A" e "B")	Wheaton
P1000 Gilson Pipetman	Gilson	F123602
Allegra Centrifugar 6KR	Beckman Coulter	366830
GH Rotor 3.8, rotor de caçamba móvel	Beckman Coulter	360581
Centrífuga Beckman J2-21	Beckman
Beckman tubos com tampas	Beckman	355672
Branco adaptadores murada	Beckman	342327
Azul adaptadores murada	Beckman
JA-17 Rotor, rotor de ângulo fixo	Beckman	369691

Nome de anticorpos	Companhia	Número de catálogo	Espécies hospedeiras	Fator de diluição
β-Actina	Sigma	A5441	mouse	1:2000
GFAP	Santa Cruz	sc-65343	mouse	1:200
GP73	Santa Cruz	Sc-134509	coelho	1:200
HSC70	Santa Cruz	sc-7298	mouse	1:200
Laminβ	Santa Cruz	Sc-6261	cabra	1:200
Prohibitin	Santa Cruz	sc-28259	coelho	1:200
PSD95	Millipore	MAB1596	mouse	5 mg / mL
SNAP25	Abcam	ab5666-100	coelho	1:2000
Sinaptofisina	Millipore	MAB368	mouse	1:500
β-3-tubulina	Santa Cruz	sc-80016	mouse	1:200