Um método para preparar traducionalmente ativa, synaptoneurosomes intacta (SNs) de córtex cerebral de rato é descrito. O método utiliza um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose permitindo a preparação rápida de ativos SNs.
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Artigo de método
Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-
Neste artigo
Resumo
Resumo
Synaptoneurosomes (SNS) são obtidos após homogeneização e fracionamento de rato córtex cerebral. Eles são selados vesículas ou terminais isolados que romper com os terminais do axônio quando o tecido cortical é homogeneizado. Os SNs reter características pré e pós-sináptico, o que os torna útil no estudo da transmissão sináptica. Conservem as máquinas moleculares utilizados na sinalização neuronal e são capazes de captação, armazenamento e liberação de neurotransmissores.
A produção e isolamento de ativos SNs pode ser problemático mídias usando como Ficoll, que podem ser citotóxicos e centrifugação prolongada devido a alta densidade, e filtração e métodos de centrifugação, que pode resultar em baixa atividade, devido a danos mecânicos do SNS. No entanto, o uso de gradientes descontínuos de Percoll-sacarose de densidade para isolar SNs fornece um método rápido para produzir bons rendimentos de SNs traducionalmente ativo. O método do gradiente Percoll-sacarose é rápido e gentil como ele emprega condições isotônica, tem spins centrifugação menos e mais curtos e evita que as etapas de centrifugação pellet SNs e causar danos mecânicos.
Protocolo
1. Preparações 1-4
- Prepare 500 mL de tampão de meio de gradiente (GM), misturando 50 mL de uma pasta de sacarose 2,5 M, 2,5 mL de uma 1M Tris-HCl, pH 7,5 valores, e 0,1 mL de um 0,5 m EDTA, pH 8,0 estoque com mili- Q água para volume. Filtro de esterilizar a solução de alíquota, e armazenar congelados.
- Prepare um estoque de 1000x tetrodotoxina (TTX) fazendo uma solução de 1 mM em mili-Q H 2 O. Alíquotas de TTX podem ser armazenadas a -20 ° C.
- Preparar o tampão de Estimulação 10x, fazendo uma solução de 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO
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Discussão
A preparação de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose aqui descrito é um método rápido e confiável para isolar SNs ativo, que pode ser usado em uma variedade de experimentos de transmissão sináptica. Este método do gradiente, que é baseado no método desenvolvido por Dunkley et al., 3,4 é um procedimento de fracionamento subcelular cérebro que isola pré e pós-sináptica da membrana derivada vesículas que estão associados com o outro. Sem purificação adicional esses SNs são compatíveis com uma variedade de t.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a BK agosto da Universidade de Wisconsin-Madison Facility Microscópio Eletrônico para a microscopia eletrônica. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-DA026067 e P30-HD03352 (a JSM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Perfurar | 23235 | |
| CaCl 2 | Pescador | C79-500 | |
| Gás CO2 | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Pescador | A407SK-4 | |
| HCl | Pescador | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH 2 PO 4 | Pescador | P285-500 | |
| PierceSDS PAGE-Sample Prep Kit | Perfurar | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO 3 | Pescador | BP328-500 | |
| Na 2 PHO 4 | Pescador | S381-500 | |
| Sacarose | RPI | S24060 | |
| Tris Base de Dados | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxina | Sigma | T5651 | |
| Expressar Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Ferramentas de dissecção | |||
| Dounce homogeneizador, 7 mL (vem com dois pilões de vidro "A" e "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra Centrifugar 6KR | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH Rotor 3.8, rotor de caçamba móvel | Beckman Coulter | 360581 | |
| Centrífuga Beckman J2-21 | Beckman | ||
| Beckman tubos com tampas | Beckman | 355672 | |
| Branco adaptadores murada | Beckman | 342327 | |
| Azul adaptadores murada | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, rotor de ângulo fixo | Beckman | 369691 |
Tabela de anticorpos utilizados para western blots:
| Nome de anticorpos | Companhia | Número de catálogo | Espécies hospedeiras | Fator de diluição |
|---|---|---|---|---|
| β-Actina | Sigma | A5441 | mouse | 1:2000 |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse | 1:200 |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | coelho | 1:200 |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse | 1:200 |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | cabra | 1:200 |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | coelho | 1:200 |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse | 5 mg / mL |
| SNAP25 | Abcam | ab5666-100 | coelho | 1:2000 |
| Sinaptofisina | Millipore | MAB368 | mouse | 1:500 |
| β-3-tubulina | Santa Cruz | sc-80016 | mouse | 1:200 |
Referências
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....
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Reimpressões e permissões
