Visualização do transporte intracelular de carga em astrócitos cultivados

Resumo

Fonte: Creighton, B. A., et al. Visualização e análise do transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a visualização do transporte de carga intracelular em astrócitos cultivados usando uma sonda acidotrópica fluorescente que marca seletivamente vesículas endolisossômicas ácidas. A aquisição de imagens de lapso de tempo e a aquisição de pilha Z com um microscópio confocal permitem o rastreamento de cargas marcadas com fluorescência em todo o volume da célula tridimensional. A análise diferencia a carga estacionária da carga que se move em direção à periferia da célula ou ao núcleo, fornecendo informações sobre a dinâmica do transporte intracelular.

Protocolo

1. Transfecção de plasmídeos marcados com fluorescência

1. No dia anterior à transfecção ou rotulagem, semeie astrócitos na densidade desejada para imagens 24 a 48 h após a transfecção. Uma densidade recomendada para placas de 24 poços ou poços de fundo de vidro de 14 mm é de 2 x 104 células/poço.
   NOTA: Este protocolo é otimizado para transfecção de astrócitos revestidos em lamínulas de vidro de 12 mm em placas de 24 poços ou poços de fundo de vidro de 14 mm usando um método baseado em lipofecção. Os reagentes devem ser dimensionados dependendo do tamanho da placa de cultura em que os astrócitos estão crescendo.
2. Diluir o reagente de lipofecção (Tabela de Materiais) em meio de soro reduzido (Tabela de Materiais). Para otimizar a proporção de reagente de lipofecção para DNA, teste uma variedade de diluições adequadas. Por exemplo, se estiver usando o reagente empregado neste protocolo (Tabela de Materiais), dilua 2, 3, 4 e 5 μL do reagente de lipofecção em 50 μL de meio de soro reduzido.
3. Diluir 5 μg de ADN de alta pureza em 250 μL de meio de soro reduzido. Adicione 5 μL de reagente intensificador de lipofecção (Tabela de Materiais). Combine o tubo que contém o reagente de lipofecção com um volume igual da mistura de intensificador de DNA-lipofecção. Misture pipetando e incube em temperatura ambiente (RT) por 15 min.
4. Remova o meio de cultura de astrócitos e adicione a mistura de transfecção (etapa 1.3) às células gota a gota. Após uma incubação de 6 horas a 37 °C e 5% de CO2, substitua o complexo de transfecção por um volume adequado de meio de cultura de astrócitos (2 ml para placas de fundo de vidro de 14 mm). Incube por mais 24 a 72 h antes de prosseguir com a aquisição da imagem. Monitore de perto a duração da etapa de incubação para obter o melhor equilíbrio entre a expressão da proteína e a viabilidade celular.

2. Marcação de endossomos/lisossomos tardios usando sondas fluorescentes

NOTA: Algumas cargas podem ser rotuladas usando corantes fluorescentes com alta afinidade por proteínas específicas de carga. O exemplo a seguir permite a marcação de endossomos/lisossomos tardios com uma sonda acidotrópica fluorescente.

1. Diluir a sonda de marcação lisossômica (Tabela de Materiais) em 200 μL de meio de cultura de astrócitos até uma concentração de trabalho de 1 μM e aplicar aos astrócitos da etapa 1.1 a uma densidade de 2 x 104 células/poço. Incubar durante 30 min a 37 °C.
2. Lave as células uma vez com meios de cultura de astrócitos quentes e substitua por meios de imagem (Tabela de Materiais). Prossiga para a imagem ao vivo imediatamente.

3. Aquisição de imagens usando um sistema de imagem com lapso de tempo

NOTA: A imagem ao vivo com lapso de tempo deve ser feita usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade, foco definido, câmara de incubação e uma objetiva de óleo de 40x com uma abertura numérica alta (por exemplo, Plan-Apochromat 1.4NA). Uma variedade de softwares de aquisição está disponível para imagens de lapso de tempo. A seleção do sistema de microscopia e do software de aquisição deve ser baseada em sua disponibilidade e adequação aos objetivos do estudo específico. Algumas diretrizes gerais são fornecidas abaixo.

1. Coloque a câmara de cultura ou o prato no adaptador adequado no microscópio stage. Usando luz de epifluorescência, selecione a(s) célula(s) que expressa(m) proteínas fluorescentes ou sonda para registrar. Ajuste a iluminação da amostra fluorescente para visualizar a(s) célula(s) selecionada(s) usando a câmera digital. Evite usar alta iluminação que possa causar fotobranqueamento e fototoxicidade. Ajuste o foco e o zoom.
2. Adquira uma série de lapso de tempo de pilha Z única a uma frequência de 1 quadro a cada 2 s para intervalos de tempo que variam entre 300 s e 500 s usando as funções de zoom e foco definido.
   NOTA: A dinâmica de tráfego (velocidade, frequência de movimento, etc.) varia dependendo da proteína de interesse, portanto, o curso de tempo de aquisição pode exigir ajustes. Por exemplo, as mitocôndrias são menos móveis que os lisossomos e exibem pausas frequentes. Nesse caso, é mais apropriado ajustar os parâmetros de aquisição para 1 quadro a cada 5 s por 800 s.
3. Salve imagens com lapso de tempo e exporte-as como arquivos de pilha AVI ou TIFF.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal	Bovine Serum Gemini	100-106	FIJI Inativado por Calor
(Fiji é apenas a imagem J)	NIH	Versão 1.52i
Pinças de Ponta Fina	F.S.T	11254-20	Estilo #5
Fonte de luz fluorescente	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Pratos com Fundo de Vidro	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	Prato de 35 mm | Nº 1.5 Lamínula | Diâmetro do vidro de 14 mm |
Pinça Graefe	F.S.T	11054-10	Pinça Graefe Iris com pontas curvas
Corante verde fluorescente que mancha compartimentos ácidos (endossomos tardios e lisossomos)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Verde DND 26. Pré-dissolvido em DMSOS para uma solução estoque de 1mM. Diluir até à concentração de trabalho final no meio de cultura ou tampão da sua escolha.
Solução de Sal Balanceada Hank's (10x)	Gibco	14065-056	Mídia de Imagem Livre de Magnésio e Cálcio
	Life Technologies	A14291DJ	Solução de Imagem de Células Vivas
Microscópio Confocal Invertido	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			Reagente https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Reagente Reagente de Lipofecção	Technologies	11514015	Plus Reagente
de Lipofecção	Life Technologies	15338100	Reagente de Lipofectamina LTX
Incubadora de agitação orbital	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230, incubadora de agitação orbital com controle de temperatura e velocidade
Solução de penicilina/estrepomicina (100x)	Gen Clone	25-512
Solução salina tamponada com fosfato (10x)	Gen Clone	25-507x
Bromidrato de poli-D-lisina	Sigma	P7405	Dissolver em tampão Tris, pH 8,5, a 1mg/mL. Congele para armazenamento a longo prazo. Evite ciclos de congelamento e descongelamento
Meio de soro reduzido	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Frascos de cultura de tecidos	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% de acesso ao pescoço angulado, tampa de filtro ventilada hidrofóbica de 0,22um
Incubadora de cultura de tecidos	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, incubadora de cultura de tecidos com controle de
temperatura, umidade e CO2Tris-Base	Sigma	T1503	8,402 g dissolvido a um litro em água com 4,829 g Tris HCl para fazer 0,1 M Tampão Tris, pH 8,5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4,829 g dissolvido a um litro em água com 8,402 g Tris Base para fazer 0,1 M Tampão Tris, pH 8,5

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