Imagem confocal tridimensional de alta resolução da barreira hematoencefálica em uma seção do cérebro de camundongo

Resumo

Fonte: Villaseñor, R e Collin. L. Imagem confocal de alta resolução da barreira hematoencefálica: imagem, reconstrução 3D e quantificação da transcitose. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra imagens 3D de alta resolução da barreira hematoencefálica (BBB) usando microscopia confocal, mostrando seções cerebrais de camundongos coradas com anticorpos para analisar componentes da BBB e estruturas intracelulares, aplicáveis para estudar a homeostase cerebral, interações neurovasculares e disfunção BBB relacionada à doença.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

Imagem

1. confocal de alta resolução da barreira hematoencefálica Realize a
2. aquisição de imagens com um microscópio confocal de varredura a laser adequado (consulte a Tabela de Materiais) com linhas de laser em 405, 488, 561 e 633 nm para excitação de fluoróforos nas regiões azul, verde, laranja e vermelha do espectro de luz. Para aquisição de imagem, use uma objetiva de óleo 63X com uma abertura numérica de 1,4.
3. No menu de aquisição do software que controla o microscópio, defina os parâmetros de aquisição de imagem. No ....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Clone de anticorpo monoclonal de rato ER-MP12 contra CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Labels Brain Endothelial CellsUse na diluição 1:100detectar com IgG anti-rato policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo monoclonal de rato contra Podocalixina	Sistemas de P&D	MAB1556	Rótulos Lúmen de capilaresUse na diluição 1:100detecte com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de coelho contra ColágenoIV	Biotrend	BT21-5014-70	Rótulos Membrana basal dos capilaresUse na diluição 1:100detecte com IgG anti-coelho policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de cabra contra CD13	Sistemas de P&D	AF2335	Marcadores pericitosUse na diluição 1:100detecte com IgG anti-cabra policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Clone de anticorpo monoclonal de camundongo G-A-5 contra GFAP acoplado a Cy3	Abcam	ab49874	Rótulos AstrócitosUse na diluição 1:100
Anticorpo policlonal de coelho contra Iba-1	Wako	019-19741	Rótulos MicrogliaUse na diluição 1:100detectar com IgG anti-rato policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo monoclonal de rato ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Rótulos LisossomosUtilizar na diluição 1:100detetar com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) juntamente com corante AlexaFluor adequado, utilizado na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de burro contra IgG de rato (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Utilização na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de burro contra IgG de rato (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Utilização na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de cabra contra IgG de camundongo (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Uso em diluição 1:400
Meio de montagem fluorescente	Dako	S3023	Meio de montagem fluorescente Dako
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X com detectores HyD e laser de luz branca
Software de processamento de imagem	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF versão 3.1.0 build 8587
Software de análise de imagem	Bitplane scientific software	NA	Imaris versão 7.6.5 build 31770 para x64
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html