Imagem confocal tridimensional de alta resolução da barreira hematoencefálica em uma seção do cérebro de camundongo

Resumo

Fonte: Villaseñor, R e Collin. L. Imagem confocal de alta resolução da barreira hematoencefálica: imagem, reconstrução 3D e quantificação da transcitose. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra imagens 3D de alta resolução da barreira hematoencefálica (BBB) usando microscopia confocal, mostrando seções cerebrais de camundongos coradas com anticorpos para analisar componentes da BBB e estruturas intracelulares, aplicáveis para estudar a homeostase cerebral, interações neurovasculares e disfunção BBB relacionada à doença.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

Imagem

1. confocal de alta resolução da barreira hematoencefálica Realize a
2. aquisição de imagens com um microscópio confocal de varredura a laser adequado (consulte a Tabela de Materiais) com linhas de laser em 405, 488, 561 e 633 nm para excitação de fluoróforos nas regiões azul, verde, laranja e vermelha do espectro de luz. Para aquisição de imagem, use uma objetiva de óleo 63X com uma abertura numérica de 1,4.
3. No menu de aquisição do software que controla o microscópio, defina os parâmetros de aquisição de imagem. No menu suspenso de 'Tamanho da imagem', selecione um valor de 1024 x 1024 pixels. Modifique o tamanho do pixel para um valor entre 200 e 300 nm ajustando o valor do menu 'Zoom'."
   NOTA: Para a análise de estruturas intracelulares, reduza o tamanho do pixel para 75 nm. Essa configuração de tamanho de imagem aumenta substancialmente o tempo de aquisição e pode ser reduzida para 512 x 512 pixels para diminuir o tempo de aquisição criando imagens de um campo de visão menor.
4. No menu suspenso 'Velocidade de aquisição', selecione um valor de 400 Hz, ou seja, 400 linhas por segundo. No menu 'configurações do sistema', selecione o menu suspenso 'Profundidade de pixel' e altere o valor para 12 bits.
5. No software do microscópio, na guia 'aquisição', ative a opção de aquisição sequencial de quadros. Defina a espessura da seção óptica para um valor entre 0.75 e 1 μm para cada canal, modificando o valor no menu 'Pinhole'.
6. No painel de excitação fluorescente, ative o laser necessário para excitar de forma ideal os fluoróforos na amostra, por exemplo, uma linha de laser de 488 nm para um fluoróforo emissor de verde.
   NOTA: Use um visualizador de espectros de fluoróforo (consulte a Tabela de Materiais) para selecionar o laser de excitação adequado.
7. No painel para detecção de fluorescência, mova o controle deslizante para selecionar os comprimentos de onda que serão medidos em cada canal, por exemplo, entre 510 e 550 nm para um fluoróforo emissor de verde.
   NOTA: Use um visualizador de espectros de fluoróforo (consulte a Tabela de Materiais) para selecionar os comprimentos de onda de detecção adequados.
8. Adicione uma gota de óleo de imersão com um índice de refração de 1,52 no topo da lamínula com a seção do cérebro para corresponder ao índice de refração da lamínula de vidro e da objetiva. Coloque a amostra no microscópio e ligue a lâmpada epifluorescente para visualizar a amostra usando os binóculos do microscópio.
9. Usando os botões no suporte do microscópio, troque a roda do filtro para selecionar um filtro apropriado para visualizar núcleos corados com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). Use o foco grosseiro para focar o sinal dos núcleos corados com DAPI.
10. Usando os botões no suporte do microscópio, troque os filtros para visualizar o sinal de marcadores vasculares (por exemplo, CollagenIV ou CD31) e centralize o campo de visão em um segmento capilar individual.
11. Pressione o botão para iniciar o modo de varredura ao vivo. Durante a digitalização, ajuste o ganho e a intensidade do laser para cada canal para maximizar a faixa dinâmica das imagens e evitar a saturação de pixels.
    NOTA: Use uma tabela de pesquisa que rotule os pixels saturados para avaliar visualmente a saturação excessiva. Para evitar a saturação excessiva do sinal, ajuste as configurações com a amostra que se espera que tenha o sinal fluorescente mais alto.
12. Defina o valor da média da linha para 2.
    NOTA: Ao usar velocidades de aquisição mais altas, aumente esse valor para reduzir o ruído.
13. Estabeleça seções inicial e final para realizar pilhas z ópticas que abrangem todo o volume do capilar. Use um tamanho de passo de 0,45 μm.
    NOTA: Se as imagens forem usadas para quantificação subsequente, mantenha as mesmas configurações de aquisição para o conjunto de dados completo.
14. Para quantificação, adquira de 10 a 20 z-stacks por seção de pelo menos três mouses diferentes para comparações estatísticas.
    NOTA: Adquira o conjunto completo de dados na mesma sessão para reduzir a variabilidade decorrente do branqueamento da amostra e das flutuações da intensidade do laser.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Clone de anticorpo monoclonal de rato ER-MP12 contra CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Labels Brain Endothelial CellsUse na diluição 1:100detectar com IgG anti-rato policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo monoclonal de rato contra Podocalixina	Sistemas de P&D	MAB1556	Rótulos Lúmen de capilaresUse na diluição 1:100detecte com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de coelho contra ColágenoIV	Biotrend	BT21-5014-70	Rótulos Membrana basal dos capilaresUse na diluição 1:100detecte com IgG anti-coelho policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de cabra contra CD13	Sistemas de P&D	AF2335	Marcadores pericitosUse na diluição 1:100detecte com IgG anti-cabra policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Clone de anticorpo monoclonal de camundongo G-A-5 contra GFAP acoplado a Cy3	Abcam	ab49874	Rótulos AstrócitosUse na diluição 1:100
Anticorpo policlonal de coelho contra Iba-1	Wako	019-19741	Rótulos MicrogliaUse na diluição 1:100detectar com IgG anti-rato policlonal de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400
Anticorpo monoclonal de rato ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Rótulos LisossomosUtilizar na diluição 1:100detetar com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) juntamente com corante AlexaFluor adequado, utilizado na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de burro contra IgG de rato (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Utilização na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de burro contra IgG de rato (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Utilização na diluição 1:400
Anticorpo policlonal de cabra contra IgG de camundongo (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Uso em diluição 1:400
Meio de montagem fluorescente	Dako	S3023	Meio de montagem fluorescente Dako
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X com detectores HyD e laser de luz branca
Software de processamento de imagem	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF versão 3.1.0 build 8587
Software de análise de imagem	Bitplane scientific software	NA	Imaris versão 7.6.5 build 31770 para x64
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html