Injeção sub-retiniana de vetores virais no epitélio pigmentar da retina em um modelo de camundongo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Park, S. W., et al. Abordagem límbica-injeção sub-retiniana de vetores virais para terapia gênica no epitélio pigmentar da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo descreve o método de injeção sub-retiniana de vetores virais no epitélio pigmentar da retina (EPR) em um modelo de camundongo. Ele detalha o procedimento desde a anestesia e preparação ocular até a entrega precisa do vetor lentiviral, garantindo a integração e expressão do gene no EPR.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do kit de injeção e vetores virais

Prepare a seringa de microlitro equipada com uma agulha romba de 33 G esterilizada com gás óxido de etileno. Dilua os vetores virais em PBS (solução salina tamponada com fosfato) para obter um título adequado no microtubo (ou seja, 1 x 10⁶ TU / μl). Lave a seringa várias vezes com vetores virais para remover qualquer espaço morto na seringa.

2. Injeção sub-retiniana de vetores virais

Anestesie os camundongos adultos (ou seja, 6 a 8 semanas de idade) com uma injeção intraperitoneal da mistura de tiletamina e zolazepam (1:1, 2,25 mg/kg de peso corporal) e cloridrato de xilazina (0,7 mg/kg de peso corporal) ou um regime alternativo de anestesia adequado.
Dilate as pupilas com um colírio de fenilefrina 0,5% e tropicamida 0,5%.
Prepare a seringa de microlitro carregando-a com 1,5 - 2 μl de vetores virais.
Abra a pálpebra e projete o olho para expor o equador para uma injeção conveniente. Concentre-se nele sob o microscópio operacional. Mantenha a posição dos olhos salientes até terminar a injeção, ou pode ocorrer deslocamento da agulha durante a injeção. Para segurar o globo ocular com firmeza, coloque os dedos fora da borda orbital.
Aplique uma gota de solução viscoelástica oftálmica na superfície da córnea.
Coloque uma pequena lâmina de cobertura redonda na parte superior da córnea para visualizar a retina.
Perfure um pequeno orifício na parte ligeiramente posterior ao limbo usando uma agulha estéril 30 G 1/2 para injeção sub-retiniana adicional. Por conveniência, faça o orifício inferior para o olho direito e superior para o olho esquerdo.
NOTA: Se o orifício for feito no temporal ou nasal, é difícil ser coberto pela pálpebra após a injeção. A punção inicial deve ser feita ligeiramente posterior ao limbo para evitar os vasos límbicos que correm ao longo do limbo e podem ser facilmente reconhecidos. Tenha cuidado para evitar bater na lente com uma agulha ao fazer a punção inicial. Não insira todo o chanfro da agulha para evitar furos na lente.
Coloque a agulha romba de 33 G da seringa de microlitro através do orifício pré-perfurado e aproxime-se da agulha no espaço sub-retiniano até sentir uma resistência leve.
NOTA: Para a injeção sub-retiniana, o melhor ângulo de aproximação da agulha é de cerca de 45 graus contra o plano da íris, e a agulha romba deve ser empurrada posteriormente em direção à área peripapilar. O quadrado pontilhado indica o caminho sugerido da agulha através da cavidade vítrea para a injeção sub-retiniana na Figura 1.
NOTA: Não haverá resistência sentida ao perfurar (ou passar) as camadas da retina, pois elas são muito macias. Assim, a primeira sensação de resistência leve indica que a agulha já tocou a camada de EPR (epitélio pigmentar da retina) e a inserção da agulha deve ser interrompida. Tenha cuidado para não penetrar no tecido escleral com pressão excessiva, pois a agulha deve ser colocada no espaço sub-retiniano potencial. Se a agulha perfurar o tecido escleral por força excessiva, ela entra nos espaços orbitais extraoculares sem resistência. (Esta etapa é crítica)
Injete os vetores virais (por exemplo, 1 x 10⁶TU / μl) suavemente no espaço sub-retiniano sem tremor para evitar danos indesejados aos tecidos. Em seguida, retire a agulha com cuidado. Segure o globo ocular firmemente durante a injeção, conforme descrito em 2.4.
Observe a formação de bolhas sub-retinianas após a injeção sob um microscópio cirúrgico para garantir que não haja sangramento retiniano.

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Resultados

Figura 1. Diagrama esquemático da injeção sub-retiniana. Seção transversal corada com H&E (coloração de hematoxilina e eosina) do olho do camundongo representando as estruturas com um caminho de agulha para a injeção sub-retiniana marcad...