Imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico

Resumo

Fonte: Katsalifis, A., et al. Imagem ao vivo do estado redox de glutationa mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador fluorescente raciométrico. Ao aplicar dois comprimentos de onda de excitação sob um microscópio de fluorescência, a taxa de intensidade de fluorescência é medida para avaliar a oxidação mitocondrial. O protocolo inclui estimulação de N-metil-D-aspartato (NMDA) para induzir o influxo de cálcio e a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), seguida de calibração usando agentes oxidantes e redutores para quantificar a oxidação mitocondrial induzida por NMDA.

Protocolo

1. Células de carregamento com perclorato de éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE)

NOTA: Neste protocolo, o TMRE é usado no modo sem têmpera a uma concentração final de 20 nM. Em geral, deve ser utilizada a concentração mais baixa possível de TMRE que ainda forneça intensidade de sinal suficiente no microscópio de escolha. Devido à evaporação desigual, o volume do meio em diferentes poços pode diferir em culturas primárias de longo prazo. Para garantir uma concentração consistente de TMRE em todos os poços, não adicione TMRE diretamente aos poços. Em vez disso, substitua o meio em cada alvéolo pela mesma quantidade de meio contendo TMRE. O protocolo abaixo é projetado para neurônios primários em placas de 24 poços contendo ~ 1 mL de meio por poço.

1. Trabalhando em uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos, colete 500 μL de meio de cada poço em um único tubo cônico.
2. Por poço, adicione 0,5 μL de estoque de 20 μM TMRE no tubo cônico (por exemplo, 12 μL para 24 poços).
3. Aspirar cuidadosamente o meio restante do primeiro alvéolo e substituí-lo por 500 μL de meio contendo TMRE. Continue, poço a poço, com os poços restantes.
   NOTA: Tome cuidado para não deixar as células secarem e não perturbá-las.
4. Retorne as células para a incubadora e aguarde pelo menos 60 min para o equilíbrio do corante.
   OBS: O tempo de carregamento pode ser estendido para várias horas sem efeitos adversos.
5. Para garantir uma concentração e equilíbrio consistentes de TMRE durante todo o experimento de imagem, certifique-se de incluir uma concentração final de 20 nM TMRE no tampão de imagem e em todas as soluções de estimulação.

2. Otimização das configurações do microscópio confocal de varredura

NOTA: Esta etapa visa encontrar o melhor compromisso entre a qualidade da imagem e a viabilidade celular durante a aquisição de imagens ao vivo. Esta seção descreve a otimização das configurações para imagens de proteína fluorescente verde sensível à oxidação por redução (roGFP). Se a imagem multiparamétrica for realizada, uma otimização semelhante, incluindo a verificação de uma linha de base estável sem sinais de branqueamento ou fototoxicidade, precisa ser realizada para os indicadores adicionais.

1. Inicie o microscópio confocal e carregue as configurações padrão para imagens GFP (excitação de 488 nm, emissão de 505 - 550 nm).
2. Defina o detector para 12 bits ou 16 bits. nota: Normalmente, 8 bits não são suficientes para imagens quantitativas.
3. Ative o modo de varredura sequencial e adicione uma segunda sequência/trilha (excitação de 405 nm, emissão de 505 - 550 nm).
4. Para ambos os canais, selecione uma tabela de pesquisa de pseudocor que indique pixels superexpostos e subexpostos (por exemplo, GLOW OU).
5. Selecione uma objetiva que seja adequada para o objeto de interesse.
   NOTA: 10x-40x são adequados para análise de célula única, 63x-100x são adequados para análise de mitocôndria única.
6. Monte uma lamínula com células na câmara de imagem, adicione 1 mL de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio.
7. Use a ocular e a luz transmitida para focar as células.
   NOTA: Não use luz de epifluorescência para localizar e focar as células. Mesmo em baixa potência, isso afetará adversamente as células.
8. Grave imagens com diferentes formatos de pixel. Com base nessas imagens, selecione o número de pixels mais baixo que forneça uma resolução aceitável da estrutura de interesse.
   NOTA: Normalmente, 512 x 512 pixels funcionam bem para imagens de célula única com objetivas de 20x e 40x, e 1024 x 1024 ou 2048 x2048 pixels normalmente funcionam bem para imagens de mitocôndria única com uma objetiva de 63x.
9. Grave imagens com diferentes tamanhos de orifícios. Com base nessas imagens, selecione o maior tamanho de orifício que forneça uma resolução aceitável da estrutura de interesse.
   NOTA: Normalmente, 3-7 unidades arejadas funcionam bem.
10. Grave imagens com diferentes intensidades de laser.
    1. Ajuste o ganho e o limite do detector de acordo. Com base nessas imagens, selecione a intensidade de laser mais baixa que forneça intensidade de sinal e relação sinal-fundo aceitáveis.
       1. Para determinar a relação sinal-fundo, meça a intensidade do sinal em uma região de interesse (ROI) que contém células ou mitocôndrias (ROI1) e em uma ROI sem células ou mitocôndrias (ROI2). Em seguida, divida a intensidade da ROI1 pela intensidade da ROI2.
          >NOTA: Apontar para uma relação sinal-fundo de >3 e intensidades de sinal de ROIs individuais de 200-1.000 para excitação de 405 nm com 1-3% de potência do laser e intensidades de ROIs individuais de 300-1.500 para excitação de 488 nm com 1% de potência do laser.
11. Grave imagens com diferentes velocidades de digitalização e número de médias de quadros. Grave de 4 a 5 imagens para cada combinação de configurações. Com base nessas séries de imagens, selecione as configurações de velocidade mais alta e média mais baixa que forneçam ruído de imagem aceitável e variabilidade de imagem para imagem.
    NOTA: Uma velocidade de varredura de 600 Hz e 1-2 quadros para média funciona bem na maioria dos casos.
12. Usando uma nova lamínula, registre uma série de lapso de tempo com as configurações otimizadas.
    NOTA: A duração e o intervalo de imagem da série devem ser semelhantes aos dos experimentos planejados.
13. No final da série de lapso de tempo, adicione 1 mL de solução de 2x Diamida (DA) à câmara de registro. Imagem por mais 2 min.
14. Aspire o tampão de imagem usando uma bomba peristáltica ou pipeta portátil. Adicione 1 mL de solução 1x Ditiotreitol (TDT). Imagem por mais 5 min.
15. Analise o experimento de lapso de tempo.
    1. Verifique se nenhum dos dois canais fica superexposto ou subexposto durante o tratamento de DA e DTT com as configurações otimizadas.
    2. Certifique-se de que nenhum dos dois canais apresente um branqueamento considerável durante a gravação em time-lapse; procure uma perda de intensidade de <2% entre a primeira e a última imagem.
    3. Verifique se a proporção de 405:488 não muda consideravelmente durante a imagem.
16. Repita todo o procedimento de maneira iterativa, usando várias lamínulas, até que as configurações que forneçam resultados aceitáveis de forma consistente tenham sido definidas.

3. Avaliação do status redox basal

1. Ligue o microscópio e carregue as configurações otimizadas da seção 2.
2. Defina a média do quadro para 3-5.
3. Monte uma lamínula com células na câmara de imagem, adicione 1 mL de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio.
4. Use a ocular e a luz transmitida para focar as células.
   NOTA: Não use luz de epifluorescência para localizar e focar as células. Mesmo em baixa potência, isso afetará adversamente as células.
5. Mude para o modo de varredura e use o canal de 488 nm na visualização ao vivo para focar e localizar células para geração de imagens.
6. Use a função multiponto para selecionar 3-5 campos de visão na lamínula.
7. Grave uma imagem de linha de base.
8. Adicione 1 mL de solução 2x DA à câmara.
9. Após 1, 2 e 3 min, use a visualização ao vivo para confirmar/ajustar o foco e, em seguida, grave uma imagem.
   NOTA: As células geralmente são totalmente oxidadas após 2 min.
10. Substitua o tampão na câmara de imagem por 1 mL de 1x solução de TDT.
11. Após 3 e 5 minutos, use a visualização ao vivo para confirmar/ajustar o foco e, em seguida, grave uma imagem.
    NOTA: As células geralmente são totalmente reduzidas após 4-5 minutos.

4. Imagem ao vivo de tratamentos agudos

NOTA: O protocolo abaixo descreve a imagem da resposta redox mitocondrial ao tratamento com NMDA. Os intervalos de imagem e a duração do experimento podem precisar ser ajustados para outros tratamentos.

1. Inicie o microscópio e carregue as configurações otimizadas da seção 3.
2. Defina o intervalo de lapso de tempo para 30 s e a duração para 25 min.
3. Monte uma lamínula com células na câmara de imagem, adicione 1 mL de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio.
   NOTA: Para evitar desvio de foco térmico, deixe as células na platina do microscópio por 10 a 15 minutos antes de iniciar a imagem com lapso de tempo.
4. Use a ocular e a luz transmitida para focar as células.
   NOTA: Não use luz de epifluorescência para localizar e focar as células. Mesmo em baixa potência, isso afetará adversamente as células.
5. Mude para o modo de varredura e use o canal de 488 nm na visualização ao vivo para focar e localizar células para geração de imagens.
6. Opcional: para aumentar o número de células gravadas por execução, use a função multiponto para criar imagens de 2 a 3 campos de visão por lamínula.
7. Inicie a aquisição de lapso de tempo e grave 5 imagens como gravação de linha de base de 2 minutos.
8. Adicione 500 μL de solução 3x NMDA à câmara (concentração final de 30 μM) e registre 20 imagens adicionais como uma resposta NMDA de 10 min.
   NOTA: Os neurônios são muito sensíveis a mudanças na osmolaridade. Portanto, certifique-se de minimizar a evaporação do tampão de imagem. Para tratamentos mais longos, a câmara de imagem deve ser coberta com uma tampa.
9. Adicione 500 μL de solução 4x DA à câmara e grave mais 6 imagens (calibração máxima de 3 min).
10. Aspire o tampão da câmara de imagem e substitua-o por 1 mL de 1x solução de TDT. Grave mais 10 imagens (calibração mínima de 5 min).
11. Encerre a gravação e salve a série de imagens.

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