Modulando a excitabilidade cortical em um rato usando estimulação magnética transcraniana repetitiva

Resumo

Fonte: Beom, J., et al. Estimulação magnética transcraniana repetitiva no hemisfério unilateral do cérebro de ratos. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a aplicação da estimulação magnética transcraniana repetitiva (EMTr) em ratos anestesiados para modular a excitabilidade cortical. O procedimento envolve a determinação do limiar motor (MT) para estabelecer a estimulação basal, seguida pela aplicação de rTMS em uma intensidade acima do MT para induzir a despolarização neuronal. Essa estimulação desencadeia o influxo de cálcio, promove a produção de fatores neurotróficos e aumenta a plasticidade sináptica, influenciando a excitabilidade cortical.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Configuração

1. experimental Preparação animal
   1. Permitir que ratos Sprague-Dawley machos se adaptem ao novo ambiente por 1 semana antes de iniciar o experimento.
      NOTA: Embora ratos com 8 semanas de idade tenham sido usados no presente estudo, um cérebro em desenvolvimento ou adulto pode ser escolhido de acordo com as hipóteses de pesquisa.
2. Anestesia inalatória para indução
   1. Induza e mantenha a anestesia com 5% e 2% de isoflurano dissolvido em 40%/60% e 25%/75% de oxigênio/nitrogênio por meio de uma câmara e cone nasal, respectivamente. Ajuste a profundidade da anestesia para o nível de abolição do reflexo de retirada do pedal para pinçar o dedo do pé para confirmar a anestesia adequada.
      NOTA: O uso de animais acordados pode ser uma escolha melhor em termos translacionais, mas há dificuldades em conter durante a EMTr e eles são propensos a estresse excessivo.
   2. Monitore a temperatura corporal com uma sonda retal e mantenha-a a 37 °C usando um cobertor homeotérmico. Monitore a profundidade do anestésico usando reflexo de retirada do pedal, temperatura, frequência respiratória e frequência cardíaca.
3. Mude para anestesia intravenosa para manutenção
   1. Prepare a cauda com um cotonete embebido em álcool. Cateterize uma veia da cauda lateral com um cateter venoso de calibre 24 para transição para anestesia intravenosa (IV) (Figura 1A). Carregue propofol por via intravenosa (1 mg/[kg·min] durante 10 min, usando 10 mg/ml de emulsão) para os animais. Interrompa o isoflurano 5 minutos após iniciar o carregamento de propofol.
   2. Mantenha a sedação com propofol a uma taxa de infusão de 500 - 700 μg / (kg · min) durante todo o experimento, como em um estudo anterior. Suplemente oxigênio a 0,8 L/min por meio de um cone nasal.
      NOTA: A anestesia com propofol é para reduzir a supressão potencial da excitabilidade cortical pelo agente inalatório. No entanto, a anestesia não é obrigatória em experimentos com EMTr, e animais acordados também podem ser usados. Os métodos de anestesia devem ser decididos levando em consideração as hipóteses de pesquisa.
   3. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   4. Aplique estimulação magnética (ver Seção 2) 10 min após a transição completa para anestesia IV.
4. Condições de recuperação
   1. Monitore os sinais vitais durante a fase de recuperação. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Se um animal foi submetido a cirurgia, não o devolva à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
      OBS: Se for realizada cirurgia para um modelo de doença, é necessário o controle da dor pós-cirúrgica. No entanto, o controle da dor não é necessário para este experimento de EMTr.

2. Estimulador de Estimulação Magnética Transcraniana Repetitiva

1. e coil
   1. Aplique a estimulação usando um estimulador repetitivo que fornece estímulos bifásicos por meio de uma bobina de 25 mm em forma de 8. Localize o centro da bobina 0,5 cm lateral ao vértice na linha biauricular e angule a bobina 45° em relação ao solo.
      NOTA: A intensidade máxima do campo magnético da bobina é de 4,0 T. A bobina magnética é montada firmemente em um suporte embutido.
2. Limiar motor
   1. Determine o limiar motor (MT) no ponto quente, com o centro da bobina posicionado 0,5 cm lateral ao vértice na linha biauricular e com a superfície plana na calvária. Esta é a mesma metodologia utilizada em estudo anterior.
      NOTA: Defina TM como a intensidade mínima do estímulo que evoca 5 ou mais contrações palpáveis na pata dianteira contralateral por 10 estímulos consecutivos. Verifique se a estimulação está causando principalmente contração muscular contralateral para garantir a estimulação unilateral.
3. Aplicação de rTMS
   1. Aplique rTMS 10 min após a estabilização da anestesia profunda. Coloque o centro da bobina no local alvo da EMTr, selecionado a partir dos córtices cerebrais, dependendo das questões de pesquisa. Em seguida, incline a bobina para garantir o contato direto entre o centro da bobina e a superfície do crânio no ponto de estimulação.
      NOTA: Por exemplo, angule a bobina 45° em relação ao solo para minimizar um potencial efeito direto da EMTr no córtex contralateral (Figura 1B e 1C).
   2. Submeter os animais a uma sessão de EMTr de 20 minutos do hemisfério unilateral. Usando o console do software, forneça rTMS com um protocolo de estimulação de baixa frequência (1 Hz), alta frequência (20 Hz) ou simulado e defina a intensidade da estimulação em 100 - 110% do MT.
   3. Execute a estimulação de 1 Hz sem repouso. Usando o console do software, insira "1.200" fotos por "20" min. Para estimulação de 20 Hz, conduza 2 segundos de estimulação seguidos de 28 segundos de repouso. Usando o console de software, insira "1.600" fotos por "20" min.
   4. Para estimulação simulada, incline a bobina perpendicularmente (rotação de 90 °) para a calvária e coloque a borda da bobina a 2 cm de distância da superfície da cabeça (Figura 1D). Fixe o suporte da bobina firmemente ao aparelho principal; não há necessidade de segurar a bobina com a mão durante o experimento.
      NOTA: Para compensar efeitos acústicos e outros efeitos inespecíficos, protocolos simulados distintos devem ser usados para protocolos de estimulação distintos. Por exemplo, a estimulação simulada de 1 Hz pode ser usada para experimentos de rTMS de 1 Hz.
4. Resfriamento da bobina
   1. Use um sistema de resfriamento a água para permitir a estimulação magnética repetitiva por mais de 20 minutos em frequências de estimulação de 1 e 20 Hz (Figura 2). Circule água gelada ao redor de todo o comprimento da bobina durante o experimento para evitar superaquecimento, embora a temperatura da bobina ou estimulador não seja monitorada.
      NOTA: Bobinas de rato resfriadas disponíveis comercialmente também podem ser usadas.
   2. Se possível, monitore a temperatura da bobina visualizando o medidor de aquecimento da máquina rTMS.
      NOTA: Não houve consequências adversas relacionadas à estimulação da rTMS. Existe, no entanto, um risco potencial de queimadura se etiquetas de identificação auriculares de metal forem usadas perto da bobina de estimulação.

Resultados

Figura 1. Configurações experimentais. (A) Um cateter intravenoso é inserido em uma veia da cauda lateral (seta) e um cone nasal é usado para anestesia com isoflurano, bem como para suplemento de oxigênio apó...

Materiais