Microinjeção de cérebro de roedor usando uma microagulha de quartzo

Resumo

Fonte: Paolone, G., et al. Agulhas personalizadas para microinjeções no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma injeção de microagulha de cérebro de roedor usando uma microagulha de quartzo com orifícios. A microagulha é conectada a uma seringa e microbomba para controlar a taxa de entrega. A agulha com a solução injetável é inserida no cérebro com a velocidade de entrega definida como baixa. Uma vez posicionado, a velocidade de entrega é aumentada. A agulha é retirada após uma breve pausa.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de agulhas de quartzo

1. Limpe e esterilize os capilares de quartzo (ver Tabela de Materiais) colocando-os por 5 min em água destilada, 5 min em etanol 99% e 5 min em éter dietílico.
2. Deixe os capilares sob o capô por pelo menos 1 h para deixá-los secar completamente.
3. Prepare as agulhas usando um extrator a laser de acordo com parâmetros que permitam a produção de uma agulha suficientemente longa e suficientemente fina, dependendo das necessidades individuais.
   NOTA: Usamos um extrator a laser (ver Tabela de Materiais). Use um programa de duas linhas para puxar. A primeira linha usa alta potência, o maior comprimento de varredura (correspondente ao VALOR DO FILAMENTO) e nenhuma força de tração. Essa combinação de parâmetros leva à fusão da maior porção do capilar com a menor velocidade de extensão, permitindo a modelagem de uma agulha longa com um grande tamanho interno/externo e haste reduzida. Desta forma, a agulha preserva uma alta resistência mecânica e um amplo diâmetro interno que permite a passagem de células-tronco ou partículas virais sem entupimento. A velocidade e o atraso desta linha de programa devem interromper a extensão capilar antes que a ponta se torne muito pequena e longa, perdendo as características mecânicas e de forma necessárias. A segunda linha do programa de tração é executada automaticamente assim que o quartzo esfria (5 s). Os parâmetros de potência, filamento e força de tração são funcionais para cortar uma ponta com o menor comprimento de ponta possível e haste íngreme, evitando a separação das duas agulhas com uma ruptura da ponta. Rotineiramente, com nossos equipamentos, utilizamos o seguinte: (a) Linha 1 = potência 990, filamento 5, velocidade 130, atraso 110, tração 0; (b) Linha 2 = potência 970, filamento 3, velocidade 0, atraso 70, tração 0.
4. Coloque as agulhas em uma placa de Petri previamente limpa com etanol 70%.
   1. Cubra o prato com um filme plástico de parafina.
5. Corte os capilares com o microdissetor.
   1. Na inicialização, deixe o laser executar um processo de autocalibração para verificar a potência e a energia fornecidas. Em seguida, defina os parâmetros de corte.
      NOTA: Usamos um microdissector (consulte a Tabela de Materiais) e os seguintes parâmetros: energia de pulso de potência do laser (63 μJ), diâmetro do feixe de laser de 20% da abertura máxima (abertura máxima: 1.0 μm) e velocidade de corte de 10% da velocidade máxima (velocidade máxima: 30 μm/s).
   2. Fixe firmemente a agulha na mesa do microscópio e posicione sua ponta no centro da tela do computador.
   3. Na barra de menus, clique no ícone de lápis e use-o para desenhar uma marca para o corte a laser da agulha.
      NOTA: O corte deve estar em um ângulo de cerca de 45° em relação à superfície da agulha.
   4. Na função da barra lateral, selecione a bandeira que contém o botão "START CUT" para permitir que o laser corte o ponto marcado anteriormente.
   5. Se necessário, cortar o(s) orifício(s) lateral(is) repetindo os procedimentos descritos no ponto 1.5.2-3; não é necessário reposicionar a agulha (figura 1).
6. Limpeza pós-corte.
   1. Conecte a agulha a uma bomba vazia através de um tubo de plástico.
   2. Ligue a bomba e ajuste manualmente a vazão direta a uma velocidade moderada (3 μL/min).
   3. Aspire primeiro o etanol a 99% e depois a água destilada para remover as impurezas devido ao corte.
   4. Aspire novamente o etanol a 99% para facilitar a secagem.
      NOTA: Cada etapa deve durar pelo menos 3 min.
7. Guarde as agulhas em uma placa de Petri devidamente coberta até o dia da cirurgia.
8. As agulhas podem ser reutilizadas; no final do experimento, limpar com água sanitária e etanol para remover a solução e possíveis resíduos de tecido. Para uma limpeza mais completa, coloque as agulhas em um frasco de armazenamento de micropipetas com a ponta voltada para baixo, encha o frasco com água destilada até que as pontas estejam cobertas, ferva por 1,5 min para remover qualquer resíduo de tecido e depois lave com etanol.

2. Procedimento

1. Seguindo as instruções fornecidas pelo manual do usuário da bomba, selecione o menu de configurações para calibrar a bomba de acordo com o diâmetro/volume da seringa de microinjeção e defina a vazão em 0,3 μL/min.
2. Encha uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha romba (por exemplo, agulha Hamilton, 30 G) e um tubo curto de politetrafluoretileno com água estéril e use-a para encher a seringa de microinjeção (depois de remover o pistão com muito cuidado) e o kit de peças do conjunto de injeção para a bomba de microinjeção manual (MMP).
   NOTA: O KIT MMP é usado para montar com segurança a agulha na estrutura estereotáxica (Figura 2). O kit inclui um tubo de politetrafluoretileno, um acoplador luer-to-tubing, um suporte de pipeta e juntas para pipetas com diferentes diâmetros externos.
3. Conecte a agulha ao kit MMP.
   1. Lave mais água em todo o sistema através da seringa de 10 mL e verifique se a água sai da agulha.
      NOTA: Certifique-se de remover quaisquer bolhas de ar dentro do sistema repetindo as etapas de enchimento.
4. Desconecte a seringa de 10 mL da seringa de microinjeção enquanto empurra lentamente o pistão para deixar uma gota de água na parte superior da seringa de microinjeção. Insira o pistão na seringa de microinjeção.
5. Conecte a seringa de microinjeção à bomba e ajuste a vazão em 0.3 μL/min.
   NOTA: Aguarde até que haja uma gota vazando da ponta da agulha e deixe agir por mais 3 min.
6. Defina o fluxo em 0,1 μL / min e inicie o procedimento cirúrgico. A bomba deve estar funcionando durante a realização da cirurgia.
   OBS: Para os experimentos relatados neste artigo, utilizamos ratos Sprague Dawley machos de 300 g (3 meses de idade). No entanto, o procedimento é aplicável a outras espécies, em particular aos ratos.
7. Induza a anestesia geral usando um método aprovado pelos regulamentos locais.
   NOTA: Usamos uma mistura de injeção intraperitoneal (i.p.) de 85 mg/kg de cetamina e 8 mg/kg de xilazina por 20-50 min de anestesia. É importante que as pinças da cauda e/ou dos dedos dos pés sejam usadas para garantir que o animal esteja totalmente sedado. O nível de anestesia e os sinais vitais básicos são avaliados antes do início da cirurgia e monitorados a cada 10 minutos durante a realização da cirurgia. A temperatura corporal do animal é mantida constante antes, durante e após os procedimentos cirúrgicos usando uma almofada de aquecimento de recirculação de água. Os animais são monitorados até que estejam totalmente recuperados (por exemplo, estão em pé e ambulatórios). Além disso, os animais recebem analgésicos (tramadol, 5–7 mg/kg i.p.) no pós-operatório a cada 24 horas durante três dias.
   1. Raspe a cabeça do animal e prepare adequadamente o local cirúrgico para a cirurgia asséptica. Realize uma lavagem em dois estágios com solução à base de iodo (Betadine) seguida de etanol a 70%. Além disso, para manter a assepsia, envolva o local cirúrgico com um campo cirúrgico (no vídeo foi omitido para fins de demonstração).
8. Posicione o rato na estrutura estereotáxica sobre uma manta de aquecimento que recircula água. Para proporcionar alívio adicional da dor, no local da cirurgia, aplique solução de lidocaína a 0,5% (não exceda 7 mg/kg). Pré-esterilize todos os instrumentos cirúrgicos usando um esterilizador de esferas ou desinfecção líquida a frio, imergindo o equipamento em glutaraldeído a 2% mais fenol a 7.05% (Esporodicina ou Cidex), seguido de um enxágue com água estéril ou solução salina. A desinfecção deve ser realizada mesmo entre os procedimentos. Faça um corte longitudinal sobre o crânio usando um bisturi esterilizado. Seja gentil para evitar sangramento excessivo. Abra o couro cabeludo usando uma espátula plana e aplique clipes cirúrgicos nas abas de pele para mantê-lo aberto. Muito suavemente, destaque o periósteo para expor o bregma e a área do crânio através da qual a agulha será inserida.
9. Monte o braço na estrutura estereotáxica (enquanto o fluxo está em andamento) e mova a ponta da agulha exatamente em cima do bregma, prestando atenção para não quebrar sua ponta. Anote as coordenadas ântero-posterior e médio-lateral do bregma e translade para as coordenadas desejadas. Guiado por um estereomicroscópio, abaixe a agulha até que sua ponta quase toque o crânio, marque o ponto de perfuração depois de levantar um pouco o braço estereotáxico.
10. Perfure (ponta da broca Ø: 0,8 mm; velocidade da broca: 1.000 rpm) o crânio no local marcado. Deve-se tomar cuidado para não penetrar na dura-máter durante os procedimentos de perfuração. Durante a perfuração, goteje solução salina estéril para evitar danos ósseos e necrose.
11. Corte um pequeno pedaço de filme plástico de parafina e coloque-o no crânio. Usando a pipeta de 10 μL, faça uma gota da solução para injetar no filme plástico de parafina. Pare a bomba, recupere levemente o empurrador da bomba e crie uma pequena bolha de ar no capilar puxando suavemente o pistão da seringa de microinjeção.
12. Abaixe o braço estereotáxico até que a ponta da agulha atinja a gota. Retirar a amostra puxando (muito lentamente) o pistão da seringa de microinjecção, evitando a formação de bolhas. Substitua o empurrador da bomba em contato com o pistão e ligue a bomba a uma vazão de 0.3 μL/min. Aguarde a formação de uma gota (alguns minutos) antes de prosseguir para a próxima etapa.
    NOTA: No presente experimento de exemplo, o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) foi infundido no estriado [AP (Anteroposterior): +1,5, ML (Mediolateral): ±2,7; VD (Dorsoventral): -5,0] e no hipocampo dorsal (AP: -3,5, ML: ±2,1; DV: -3,5; em mm da dura-máter), 2 μL/local. Para facilitar a comparação entre os dois métodos de injeção, cada área do cérebro foi infundida usando uma agulha de quartzo em um hemisfério e uma ponta romba de 26 G ou uma agulha de aço inoxidável de ponta chanfrada de 30 G no outro.
13. Abaixe o fluxo para 0,1 μL / min, corte a dura-máter com uma agulha de ponta chanfrada de aço inoxidável e abaixe lentamente o braço estereotáxico no eixo dorso-ventral, entrando no tecido cerebral. Quando a posição desejada for alcançada, desça mais 0,1 mm, pare a bomba, levante o braço estereotáxico em 0,1 mm e inicie novamente a bomba no fluxo para 0,3 μL/min.
    NOTA: A razão para manter um fluxo lento enquanto abaixa a agulha é garantir uma pressão positiva que evite a penetração de pequenos fragmentos de tecido na própria agulha. Tal evento obstruiria a ponta, prejudicando a entrega da solução. Como a taxa de fluxo é muito lenta ao abaixar a agulha e a velocidade de abaixamento é de cerca de 10 s/mm, isso implica que as quantidades de solução que permanecem ao longo do trajeto da agulha são insignificantes em comparação com as injetadas no local alvo. Esta precaução pode ser evitada ao usar agulhas com orifícios laterais.
14. Inicie o temporizador e aguarde o tempo necessário dependendo do volume desejado para injetar (por exemplo, 6 min 40 s se injetar 2 μL). Monitore o movimento da bolha durante a injeção. No final, pare a bomba e espere 5 minutos antes de recuperar lentamente a agulha. Quando a agulha de quartzo estiver completamente extraída, ligue a bomba novamente e verifique a formação de uma gota na ponta da agulha.
15. Sele a abertura na superfície do crânio com cera óssea, remova os clipes hemostáticos e suture o couro cabeludo, cubra a área ao redor da ferida com um creme antibiótico (por exemplo, neosporina) e devolva o animal à gaiola de casa.

Resultados

Figura 1: Imagem microscópica de uma ponta de agulha de quartzo, mostrando diferentes diâmetros da ponta e orifícios empregados para a injeção de fluidos. Imagem de baixa ampliação em (A) e maior ampliação em (B) e (C). A agulha pode ser prepa...

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