Imagem tridimensional de astrócitos imunomarcados usando microscopia confocal

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Animais, cirurgia e preparações de amostras

NOTA: Prepare o tecido cerebral para análise microscópica confocal tridimensional (3D).

1. Divida os animais aleatoriamente em dois grupos: beta amilóide (Aβ) _1-40\u2012injeção (n = 8) e Aβ_1-40\u2012injeção com tratamento com genisteína (n = 8); administre genisteína (10 mg/kg diluído em um veículo como óleo de rícino polietoxilado) por gavagem 1 hora antes da cirurgia.
2. Anestesiar os animais com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confirme a anestesia adequada pela falta de reflexo de retirada após beliscar o dedo do pé. Use pomada nos olhos durante a cirurgia para evitar o ressecamento.
3. Coloque os animais em aparelhos estereotáxicos e raspe a cabeça. Aplique solução de iodo para limpar o couro cabeludo antes da incisão e mantenha o local da operação estéril durante a cirurgia para reduzir o risco de infecção. Injete Aβ_1-40 estereotaxicamente (4 μl) no hipocampo a −3,5 mm posterior ao bregma, ± 2 mm lateral à linha média e −2,8 mm abaixo da dura-máter, de acordo com o atlas do cérebro de ratos.
4. Fornecer observação/cuidados pós-operatórios até que os animais estejam totalmente conscientes para garantir o conforto dos animais. Mantenha os animais aquecidos durante a recuperação e não os devolva a uma gaiola com outros animais até a recuperação total. Preste atenção a quaisquer sinais de infecção nos animais após a cirurgia.
5. Anestesiar os animais profundamente com cetamina (150 mg/kg) três semanas após a cirurgia. Realize a fixação transcárdica perfundindo os animais com solução salina a 0,9% seguida de paraformaldeído a 4% em solução salina tampão fosfato 0,1 M ou PBS (pH = 7,4), remova e fixe o cérebro.
6. Pós-fixar os cérebros em paraformaldeído a 4% por 2-3 dias a 4 °C.
7. Incorpore o tecido em blocos de parafina usando equipamento de incorporação de tecido e evite encher demais ou encher demais o, pois isso pode interferir no alinhamento ou seccionamento correto. Preste atenção à orientação do tecido no bloco de parafina.
   NOTA: O hipocampo de ratos, por exemplo, está próximo à parte posterior do hemisfério cerebral. Assim, o tecido deve ser incorporado de forma que a secção comece na parte posterior do cérebro. Use o atlas de Paxinos como guia para alcançar a estrutura anatômica desejada.
8. Coloque o micrótomo longe de correntes de ar ou portas, pois os movimentos de ar dificultam o manuseio das seções.
9. Use cortes com espessura ≥20 μm, pois essa profundidade será necessária para produzir imagens Z-Stack de astrócitos completos. Não use as primeiras seções, pois elas podem ter espessura indesejada devido à expansão térmica.
10. Coloque as seções na superfície da água quente (5 ± 2 °C, abaixo da temperatura de fusão da parafina) apenas o tempo suficiente para achatar as seções.
    NOTA: A expansão excessiva da seção pode perturbar a morfologia da estrutura. Use um pincel minúsculo para transferir cuidadosamente as seções. Colete duas a três seções em cada slide.
11. Armazene as lâminas em um rack vertical e deixe-as secar a 37 ° C por várias horas ou durante a noite (O / N).

2. Imuno-histoquímica

1. Desparafinizar cortes em xileno, 2 x 10 min, e reidratar através de gradiente alcoólico (99,8%, 95% e 70%, 10 min cada) e PBS.
2. Incubar com anticorpos contra a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) diluída 1:1.500 em PBS contendo 0,25% de albumina de soro bovino (BSA), 0,25% de Triton X-100 e 3,5% de soro normal (O/N a 4 °C).
3. Lave as seções em PBS por 3 x 5 min.
4. Incubar com anticorpos secundários conjugados com fosfato alcalino por 1h (1:100, 21 ° C, diluído em PBS).
5. Lave as seções em PBS por 3 x 5 min.
   NOTA: É importante lavar as seções adequadamente após os anticorpos secundários para minimizar a coloração de fundo.
6. Incube as seções na escuridão com Cromogênio Vermelho Permanente Líquido (15-20 min).
   Nota: Prepare a solução no máximo 30 minutos antes de usar.
7. Lave as seções em PBS por 3 x 5 min.
8. Finalmente, corar os núcleos com 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1:500, diluído em PBS) antes de deslizar a cobertura. Guarde as lâminas na geladeira por 24-48 horas antes da microscopia.

3. Microscopia Confocal

NOTA: Para avaliação quantitativa (veja abaixo), selecione um astrócito com um núcleo corado com DAPI claramente visível com um mínimo de ramos sobrepostos para reduzir o risco de erros. A produção de imagens Z-Stack é demorada. Seja paciente e não pare durante o processamento. Um microscópio de varredura a laser confocal vertical é usado para criar imagens 3D de astrócitos.

1. Coloque a lâmina no microscópio stage e selecione a objetiva 63X.
2. Abra o software de imagem e clique em Iniciar sistema. Clique na guia Localizar. Vá para Atribuir e selecione GFP para ajustar a luz adequada.
3. Abra o obturador para refletir a luz. Encontre o revólver refletor no lado direito do obturador e escolha a cor que deve ser refletida pelos astrócitos (verde, vermelho ou violeta); a cor vermelha (FSet20 wf) foi usada aqui.
   NOTA: Não se esqueça de focar a imagem diretamente na ocular do microscópio.
4. Para encontrar o melhor foco, clique em Todos Fechados, coloque o pino do microscópio no modo de tela e clique na guia Aquisição.
5. Clique em Configuração Inteligente na guia Aquisição; uma janela é aberta. Selecione o fluoróforo adequado (ou seja, DAPI e Alexa Fluor 555, no projeto atual) na lista. A cor é selecionada automaticamente.
6. Clique em Melhor sinal e Aplicar, depois clique em Definir exposição; o computador definirá automaticamente os parâmetros de exposição.
7. Para otimizar a imagem, vá para a janela Canais. Desmarque a Faixa2, realce a Faixa1 e clique em Ao vivo. Concentre-se na imagem, se necessário.
8. Na janela Canais, ajuste as seguintes teclas; clique em 1AU para otimizar automaticamente o orifício. É muito importante fazer esta etapa, caso contrário, as imagens confocais não serão ideais. Ajuste o ganho para obter a melhor intensidade (mantenha esta configuração abaixo de 800 para reduzir o ruído extra). Por fim, defina o Ganho Digital entre 2 e 3.
9. Desmarque a Faixa1, clique em Faixa2 e repita a Etapa 3.8 para a Faixa2. Em seguida, pare ao vivo.
10. Vá para a janela Modo de aquisição. Melhore a imagem otimizando o tamanho do quadro e a média. Para alterar o tamanho do quadro, vá para X*Y e selecione 1.024 x 1.024. Escolha uma velocidade lenta para criar uma imagem melhor.
11. Vá para Média e selecione um Número ≥4. Esse valor médio indica o número de varreduras que serão calculadas para produzir a imagem adquirida. Agora, clique no botão Snap e salve a imagem 2D capturada.
12. Para imagens 3D, marque o item Z-Stack em Smart Setup, fazendo com que a janela Z-Stack seja aberta.
13. Defina a primeira e a última posições para o Z-Stack, ou seja, a profundidade da célula. Primeiro, clique em Ao vivo. Em seguida, use o acionamento de foco do microscópio para focar na posição superior do astrócito no tecido, onde o Z-Stack deve começar. Clique em Definir primeiro. Em seguida, concentre-se na posição mais baixa do astrócito no tecido, onde a varredura Z-Stack deve ser interrompida. Clique em Definir último. Em seguida, pare ao vivo.
14. Escolha o intervalo; 1,01 μm é usado no estudo atual; a escolha do intervalo pode ser feita clicando em Ótimo para definir o número de fatias.
15. Clique em Iniciar experimento. Salve as imagens assim que a verificação for concluída. Esta imagem será usada para a medição dos seguintes parâmetros: área de superfície e volume do território dos astrócitos, bem como de todo o astrócito, incluindo ramos, corpo celular e núcleo.