Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Injeções intramusculares nas placas terminais do motor
- Puxe as micropipetas de vidro com um extrator de micropipetas (recomenda-se o uso de micropipetas graduadas com êmbolos). Com a ajuda de um microscópio de dissecação, quebre as pontas das micropipetas com um par de pinças de modo que o diâmetro interno do lúmen da micropipeta seja de aproximadamente 0,5 mm.
- Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos usados sejam recém-autoclavados e que a área cirúrgica seja estéril.
- Encha as micropipetas com Fluoro-Gold (5% em água destilada).
- Induzir anestesia no animal usando isoflurano (4% em O2) em uma câmara de indução. Verifique o reflexo de endireitamento e certifique-se de sua ausência antes de removê-lo da câmara de indução. Prenda um cone nasal sobre o focinho do rato e administre isoflurano (2% em O2) para manutenção da anestesia. Aperte os dedos dos pés do animal e toque suavemente o olho do animal para garantir que tanto a retirada do pedal quanto os reflexos da córnea estejam ausentes.
NOTA: Uma mistura de cetamina e xilazina também pode ser usada (80 e 10 mg/kg, respectivamente, administrados por via intraperitoneal). A cetamina é uma droga da Tabela 8 ("Controlada"), e os protocolos necessários associados à compra, uso, armazenamento e descarte da droga terão que ser respeitados. - Aplique lubrificante ocular para evitar o ressecamento dos olhos durante o procedimento.
- Raspe o membro alvo e use gaze para limpar a área raspada com três esfoliações alternadas de clorexidina e álcool 70%. Transfira o animal para a área cirúrgica.
- Coloque o animal em uma almofada limpa e posicione-o adequadamente para garantir um bom acesso ao(s) músculo(s) alvo(s).
- Use uma pinça com alças de dente para levantar a pele sobre o músculo alvo para longe da musculatura subjacente e faça uma incisão na pele com uma tesoura cirúrgica. Certifique-se de que a incisão seja grande o suficiente para expor completamente o(s) músculo(s) de interesse. Certifique-se de que haja o mínimo de interrupção na fáscia.
- Use as fotografias da placa terminal motora (MEP) para transpor mentalmente a localização e a forma da região MEP para o(s) músculo(s).
NOTA: Um marcador de feltro fino pode ajudar a reproduzir a região MEP da fotografia para o(s) músculo(s) de interesse. - Realize várias injeções ao longo de todo o comprimento da região MEP (para Fluoro-Gold, 3 a 4 injeções de 1-2 μl cada devem ser suficientes). Limpe suavemente o(s) músculo(s) para remover qualquer infiltração.
- Aproxime as duas extremidades da pele incisa com uma pinça romba e feche a ferida com clipes cirúrgicos. Infiltre 0,1 ml de Bupivacaína (0,5% em água) (ou outros anestésicos locais) ao longo de toda a extensão da ferida.
- Desligue a máquina anestésica e monitore o animal até que ele se recupere totalmente da anestesia.
- Aguardar 14 dias entre a administração de injeções intramusculares e a perfusão dos animais.
