Entrega de siRNA direcionada a neurônios para silenciamento de proteínas príon usando complexos lipossomais

Resumo

Fonte: Bender, H. R., et.al. Entrega de siRNA terapêutico ao SNC usando lipossomas catiônicos e aniônicos. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a entrega direcionada de siRNA de proteína príon (PrP) aos neurônios usando complexos lipossomais de siRNA-peptídeo (LSPCs). Os lipossomas catiônicos ligam-se eletrostaticamente ao siRNA direcionado ao PrP, que é ainda estabilizado pelo peptídeo RVG-9r para transporte mediado por receptor através da barreira hematoencefálica. Uma vez dentro do cérebro, os LSPCs sofrem endocitose nos neurônios, liberando siRNA para iniciar a interferência do RNA, reduzindo a expressão de PrP e interrompendo a progressão da doença do príon.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de LSPCs

1. Use uma proporção de colesterol DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano) de 1:1 para LSPCs. Para uma preparação de lipossomas de 4 nmol, misturar 2 nmoles de DOTAP e 2 nmoles de colesterol em 10 ml de uma solução de clorofórmio:metanol 1:1 num balão.
2. Evaporar 9 ml da solução de clorofórmio:metanol utilizando o gás N₂ numa hotte. Evaporar o último 1 ml de solvente numa hotte durante a noite sem gás. Observe uma fina película lipídica no fundo do frasco.
3. Aquecer 10 ml de uma solução de sacarose a 10% a 55 °C.
4. Despeje a solução de sacarose a 10% aquecida na fina película lipídica lentamente, ou seja, 1 ml / min, enquanto gira suavemente o frasco. Manter a sacarose a 10% e o balão com lípidos a 55 °C para que as moléculas lipídicas permaneçam na fase gel-líquido. A reidratação resulta na formação de vesículas multilamelares (MLV).
5. Deixe os lipídios reidratarem a 55 ° C por pelo menos uma hora antes de dimensionar os lipossomas.
6. Monte uma extrusora de acordo com as instruções do fabricante com filtros de 1.0 μm ou use filtros de seringa de 1.0 μm para dimensionamento.
7. Adicione 1 ml da suspensão de lipossomas aquecida a uma das seringas da extrusora e passe a suspensão entre as duas seringas 11 vezes. Certifique-se de que a suspensão esteja na seringa oposta à seringa inicial após as 11 passagens.
8. Dimensione os lipossomas novamente através de filtros de 0,45 μm e depois de 0,2 μm para gerar grandes vesículas unilamelares (LUVs). Mantenha a suspensão lipossomal aquecida para facilitar o dimensionamento.
9. Incubar 20 μl da suspensão de lipossomas de 4 nmoles (200 μM) com 200 μl de uma solução de siRNA estoque de 20 μM (4 nmols no total) por 10 min à temperatura ambiente.
10. Incubar 80 μl de uma solução de estoque RVG-9r de 500 μM (40 nmol no total) com a solução de siRNA/lipossomas por 10 min em RT. Os LSPCs devem ser usados o mais rápido possível, mas podem ser usados até várias horas após a preparação. Conservar os LSPCs a 4 °C durante várias horas após a preparação.

2. Injetando camundongos com LSPCs

1. Exponha os camundongos por 5 a 10 minutos a uma lâmpada de calor para dilatar a vasculatura.
2. Anestesiar o rato com um fluxo de isofluorano/oxigénio a 2-3% 5-10 min antes da injecção, e durante a injecção. Confirme a anestesia quando o animal não estiver mais deambulando e a respiração tiver diminuído, beliscando o dedo do pé. Coloque o mouse de costas ou de lado para acessar a veia da cauda. Use pomada veterinária nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a anestesia.
3. Limpe/borrife a cauda com EtOH a 70% e injete 300 μl de LSPCs na veia da cauda do camundongo usando uma seringa de insulina 26 G. Comece a injetar distalmente na veia da cauda e mova-se proximalmente se a veia entrar em colapso ou se romper.
4. Coloque o mouse em uma gaiola limpa até que ele mantenha a decúbito esternal. Não coloque o mouse com outros companheiros de gaiola até que ele esteja totalmente recuperado. Os ratos devem se recuperar em 5 a 15 minutos. Eles podem ser colocados em uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal se a recuperação demorar mais. Os ratos devem ser monitorados de perto para proteção contra superaquecimento.
5. Monitore o animal várias horas após a injeção para garantir que a anestesia passe e que não haja efeitos nocivos do tratamento. Permita que os LSPCs circulem por pelo menos 24 horas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Colesterol	Avanti Lipids	700000
Clorofórmio	Fisher Scientific	AC268320010
Metanol	EMD Millipore	113351
N₂ Gás	AirGas
Sacarose	Fisher Scientific	S5-500
Extrusora	Avanti Lipids	610023
filtros de 1,0, 0,4 e 0,2 μm	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006