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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Ensaio de Proliferação Celular Ki67
- Ensaio de Proliferação Celular Ki67 (Imunocitoquímica)
- Enxágue as culturas de células com tampão fosfato 0,1 M (PO4) por um minuto duas vezes. Fixe a cultura com paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min em temperatura ambiente. Remova o PFA e enxágue os poços com PBS por sete minutos três vezes.
- Após o enxágue final, adicione 100 μl de solução bloqueadora (solução salina tampão fosfato, soro de burro normal a 5%, soro de albumina bovina a 0,4% e Triton X-100 a 0,2%) a cada poço e incube em temperatura ambiente por 1 hora. Prepare o anticorpo primário, anti-Ki67 de coelho, diluindo em solução bloqueadora a uma proporção de trabalho de 1:200.
- Remova a solução bloqueadora e aplique 100 μl da solução de anticorpo primário em cada alvéolo. Cobrir a placa de 96 poços e incubar as amostras a 4 °C durante a noite.
- No dia seguinte, remova a solução de anticorpos e enxágue com PBS por 7 min, 3 vezes.
- Preparar o anticorpo secundário Cy3 anti-coelho de burro em solução de bloqueio com uma proporção de trabalho de 1:500. Adicione a coloração nuclear DAPI à solução de anticorpos secundários a uma diluição de 1:100. Após a remoção do último enxágue PBS, aplique 100 μl da solução secundária de anticorpo/DAPI em cada alvéolo. Incube em temperatura ambiente no escuro por 90 min.
- Remova a solução secundária de anticorpo/DAPI e enxágue cada poço com PBS por 7 min, 3 vezes. Cubra a placa de 96 poços e armazene a 4 ° C até a obtenção de imagens.
2. Imagem automatizada e análise de pontuação em vários comprimentos de onda
- Carregue uma placa de 96 poços (previamente processada para imunomarcação Ki67) no sistema HCS e deixe a placa se equilibrar por 20 min. Abra o software de aquisição e análise de imagem do sistema HCS.
- Escolha as configurações de aquisição para a objetiva 10X usando o compartimento da câmera em 1 e uma configuração de ganho de 2. Encontre o plano Z em que as células residem utilizando a função Auto Exposure e calcule o deslocamento para cada comprimento de onda de interesse. Para esta análise, capture imagens para DAPI (W1), Cy3 (W2). Escolha o nível de intensidade máxima no qual os poços de controle negativo não mostram sinal para aquisição de imagem. Confirme se essa configuração é apropriada para os poços positivos.
- Adquira placa. Capture imagens e armazene-as no banco de dados do software de aquisição e análise de imagens.
- Depois que as imagens forem adquiridas, abra o software off-line de aquisição e análise de imagens e revise os dados da placa das imagens adquiridas acima.
- Selecione a análise de pontuação de vários comprimentos de onda. Configure as intensidades mínima e máxima para cada comprimento de onda.
NOTA: A detecção DAPI deve marcar a coloração ao redor de cada núcleo visível. O Cy3 deve detectar as células positivas com imunorreatividade (IR) Ki67 e não deve detectar IR sob os controles negativos. Para Cy3 Ki67 IR, a largura mínima aproximada foi de 7 μm, a largura máxima aproximada foi de 30 μm, a intensidade acima do fundo local foi de 150 níveis de cinza e a área mínima corada foi de 50 μm2. - Executar análise para todas as posições. Exporte os dados para visualização em planilha.