Ressecção de tumor cerebral em camundongo usando um sistema de ressecção minimamente invasivo

Resumo

Fonte: Alomari, S., et al. Implementação de ressecção minimamente invasiva de tumor cerebral em roedores para coleta de tecidos de alta viabilidade. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o uso de um sistema de ressecção minimamente invasivo (MIRS) para extirpar o tecido tumoral de um camundongo anestesiado implantado com um tumor. O procedimento envolve prender o mouse em uma estrutura estereotáxica, reabrir o local cirúrgico anterior para acessar o cérebro e inserir uma cânula especializada que utiliza sucção e uma lâmina rotativa para remover seções tumorais. Após a ressecção, o tecido excisado é coletado por meio de tubos estéreis e a ferida é fechada para permitir a recuperação.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Implantação inicial do tumor intracraniano

1. Na fase inicial do estudo, injete intracranialmente em cada camundongo 100.000 células (linha celular de glioma murino GL261) suspensas em 4 μL de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) a uma profundidade de 2,5 mm após o relatório publicado anteriormente.
2. Quantifique o sinal do tumor em cada camundongo usando o sistema de imagem in vivo 9 dias após a implantação do tumor.
   NOTA: Se necessário, estratificar os camundongos em dois grupos com base na carga tumoral. No presente estudo, os dois grupos foram: (1) camundongos com carga tumoral relativamente pequena (sinal bioluminescente médio = 5,5e+006 ± 0,1e+006 fótons/s, n = 10) e (2) camundongos com carga tumoral relativamente grande (sinal bioluminescente médio = 1,69e+007 ± 0,2e+007 fótons/s, n = 10), (p < 0,05, teste de Mann-Whitney).
3. Divida cada grupo em dois subgrupos comparáveis.
   >NOTA: Neste estudo, os dois subgrupos foram: camundongos não tratados (n = 5) e camundongos com tumores submetidos à ressecção cirúrgica usando o MIRS (n = 5), (p > 0,05, teste de Mann-Whitney).
4. A partir do dia da ressecção, acompanhe a progressão do tumor usando o sistema de imagem in vivo em uma frequência baseada no padrão de crescimento do tumor.
   NOTA: Para a linhagem celular GL261, acompanhe a progressão do tumor no dia da ressecção e depois a cada 3-6 dias.

2. Ressecção do tumor usando MIRS

1. Anestesiar o camundongo usando uma mistura de gás isoflurano-O₂ em uma câmara de indução ou injeção intraperitoneal de solução de xilazina/cetamina.
   1. Se estiver usando o anestésico gasoso, defina a taxa de fluxo de gás para 1.0 mL / min e o vaporizador para 2.0% para indução anestésica, normalmente exigindo 3-5 min na câmara (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Se estiver usando o anestésico injetável, anestesiar os camundongos injetando 0,2 mL de solução anestésica (80-100 mg / kg de cetamina e 10-12,5 mg / kg de xilazina, ver Tabela de Materiais) por via intraperitoneal.
2. Avalie o animal quanto à sedação adequada beliscando o dedo do pé. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Administre um analgésico (0,03-0,06 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea) antes do procedimento.
3. Coloque o mouse na estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais) assim que a sedação completa for confirmada.
   NOTA: Se estiver usando o anestésico gasoso, coloque o nariz do camundongo em um cone nasal onde continuará a receber a mistura de isoflurano-O₂ durante o procedimento (1,5%).
4. Remova o grampo anterior e, em seguida, remova o cabelo com um creme depilatório ou barbeando. Desinfete a pele com ciclos alternados de esfoliante à base de clorexidina/betadina e álcool. Em seguida, usando um bisturi estéril, crie uma incisão longitudinal de 1 cm na linha média ao longo da cicatriz cirúrgica anterior.
5. Prenda a peça de mão MIRS ao braço estereotáxico através do adaptador de palco/suporte da peça de mão para maior estabilidade e precisão.
6. Configure a máquina MIRS (consulte a Tabela de Materiais) usando as seguintes configurações (Figura 1).
   1. Insira o conjunto de cabos de alimentação no painel traseiro no receptáculo do cabo de alimentação. Ligue ou desligue o sistema alternando (1 = ON, 0 = OFF).
   2. Insira uma extremidade da mangueira de nitrogênio (fornecida com o console) no encaixe macho no painel traseiro do console. Gire a porca de conexão no sentido horário para apertar a conexão.
      NOTA: A extremidade oposta da mangueira precisa ser conectada ao suprimento de nitrogênio.
   3. Antes de conectar a mangueira ao suprimento de nitrogênio, confirme se a pressão de alimentação não excede 100 psig, que é a pressão de alimentação de entrada recomendada para o console.
      NOTA: O console gerará sua própria aspiração quando ativado pelo pedal assim que o nitrogênio for fornecido ao console.
   4. Prenda a tampa da porta de vácuo e feche-a para evitar qualquer vazamento no sistema de vácuo. Qualquer vazamento no sistema de aspiração afetará o desempenho do console MIRS.
   5. Se a aspiração estiver abaixo de 17 durante a configuração ou escorva, verifique se o botão de aspiração na frente do console está ajustado no nível máximo (100), certifique-se de que não haja vazamento no sistema de aspiração e confirme se a pressão de alimentação de entrada de nitrogênio está correta.
   6. Para conectar o pedal ao console, insira o conector cinza do pedal em seu receptáculo cinza até que ele se encaixe e se encaixe na posição.
      NOTA: O conector do pedal se conecta ao console em uma orientação e é chaveado.
   7. Para conectar a peça de mão ao console, insira o conector azul da peça de mão em seu receptáculo azul até que ele se encaixe e se encaixe na posição.
      NOTA: O conector da peça de mão se conecta ao console em uma orientação e é chaveado.
   8. Prepare cada peça de mão antes de usar o sistema, aspirando fluido estéril de uma tigela pequena para a abertura, através do tubo e da peça de mão e, em seguida, para o recipiente para garantir que o interior do tubo e da peça de mão seja lubrificado para reduzir as oclusões de tecido.
   9. Prepare-se para a aspiração sozinha ou para a aspiração com corte, selecionando o modo apropriado no painel frontal do console. Inicie usando o pedal.
7. Insira a cânula MIRS de 23 G no orifício da rebarba a uma profundidade de 2.5 mm.
8. Inicie o processo de ressecção pressionando o pedal conectado à cânula. Realize um ciclo completo (360°) ou mais de ressecção usando o botão de controle na peça de mão.
   NOTA: Quanto mais ciclos realizados, maior o volume de tecido tumoral ressecado.
9. Quando o processo de ressecção estiver concluído, retire a cânula 23 G MIRS do orifício da rebarba e use 5 mL de 1x PBS para lavar o tubo e desalojar quaisquer detritos residuais.
10. Remova o mouse da estrutura estereotáxica e feche a ferida com um grampeador ou material de sutura 4-0 (consulte a Tabela de Materiais).
11. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ou sob uma luz de aquecimento durante a recuperação da anestesia antes de devolvê-lo à gaiola.
12. Após a conclusão do experimento, purgue a cânula por meio de lavagem. Alterne com meio resfriado e ar para "empurrar" todo o tecido ressecado de volta para o recipiente de coleta. Remova o recipiente de coleta do sistema e tampe com a tampa fornecida.
13. Depois de concluir a etapa 2.12, coloque a ponta distal da cânula em 3% H₂O₂ e aplique sucção a 24-25 em Hg para encher a linha de sucção de volta ao recipiente de coleta de sucção e deixe descansar por 60-90 s. Lave com meio estéril pulsando ar e meio intermitentemente.
14. Monitore os camundongos quanto a quaisquer sinais neurológicos (movimentos erráticos anormais ou convulsões) após o procedimento.

Resultados

Figura 1: Configuração do sistema MIRS. (A) Sistema de ressecção minimamente invasivo (MIRS) para tumor cerebral em modelos de roedores com tecido integrado sistema de preservação. (B) Painel frontal do cons...

Materiais