Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Implante de cânula estereotáxica
- Use ratos Sprague-Dawley machos de 10 a 12 semanas.
- Anestesiar os animais com isoflurano a 1,5-2%. Assim que o animal parar de responder a um beliscão forte com uma pinça afiada, faça a cirurgia. Certifique-se de autoclavar todos os instrumentos, usar luvas cirúrgicas estéreis e adicionar pomada oftálmica aos olhos do animal para evitar danos.
- Implante estereotaxicamente cânulas guia bilaterais de calibre 26 no córtex pré-frontal (PFC) em um ângulo de 12,5 graus com coordenadas ântero-posterior (AP): +2,9 mm; mediolateral (ML): +/−1,6 mm; dorsoventral (DV): −2,1 mm. Para inserir as cânulas, faça furos no crânio nas coordenadas desejadas, com diâmetro de furo de acordo com o tamanho das cânulas utilizadas.
NOTA: Aqui, o PFC foi estudado como o alvo potencial para implantes intracranianos devido ao seu importante papel no processamento da dor, o que foi demonstrado em vários estudos anteriores. Para estudar a função de outras áreas cerebrais específicas, os pesquisadores podem usar coordenadas diferentes de acordo com o atlas cerebral. - Permita que os ratos se recuperem da cirurgia por pelo menos 1 semana. Após a cirurgia, injete fluidos subcutâneos antes da recuperação para ajudar a atender às necessidades metabólicas e aplique bupivacaína tópica na incisão recém-fechada. Coloque o animal em uma almofada quente até que ele acorde e monitore o animal após a operação por 3 dias para garantir uma boa saúde e uma recuperação adequada.
- Assim que os animais estiverem totalmente recuperados da cirurgia, inicie as injeções (próximo passo).
2. Injeções intracranianas e intraperitoneais
- Para injeções intracranianas, use um tubo PE-50 conectado em uma extremidade a seringas Hamilton de 10 μL com uma cânula injetora de calibre 33 que se estende 1,0 mm além das guias implantadas.
- Injete 0,5 μL (ou menos, se desejado) do medicamento do estudo ou solução salina no PFC desses ratos. Como o PFC é uma região maior em ratos, essa quantidade não se espalhará para outras regiões. No entanto, para regiões cerebrais menores ou para camundongos, use um volume menor. A quantidade injetada dependerá da região do cérebro e da espécie do animal.
NOTA: Observe que a solução salina deve ser usada como controle em vez do dimetilsulfóxido (DMSO) porque o DMSO é neurotóxico. No entanto, uma quantidade muito pequena de DMSO pode ser segura para infusão, pois estudos mostraram que menos de 50% de DMSO (ou seja, menos de um volume total de 0,3 μL, como neste caso) pode não interferir nos estudos de comportamento. - Injetar o volume bilateralmente durante um período de 100 s e manter as cânulas injetoras no lugar por mais 60 s antes da remoção para permitir a difusão lenta desta solução.
- Para estudos de efeitos farmacológicos sinérgicos, co-administre outro medicamento por meio de métodos sistêmicos. Nesse caso, injete o medicamento desejado ou controle por via intracraniana e administre um medicamento adicional por via intraperitoneal imediatamente depois. Como exemplo, neste estudo, estudamos os efeitos analgésicos sinérgicos da morfina e Ampakines para testar um efeito aditivo. Infundimos uma AMPAkina por via intracraniana, em combinação com a administração intraperitoneal de 1 mg/kg de morfina (uma dose sistêmica segura).
NOTA: Recomenda-se que as injeções intracranianas sejam feitas primeiro, pois são mais difíceis de realizar do que as injeções intraperitoneais.
3. Ensaios e avaliação de analgesia
- Para estudar o efeito das injeções intracranianas no comportamento da dor aguda em ratos, use o teste plantar (teste de Hargreaves) para calcular a latência de abstinência em resposta a estímulos térmicos. O aparelho de Hargreaves focaliza um feixe infravermelho através de um plano de vidro no pé do rato; O rato está de pé e se movendo livremente acima do plano de vidro. Ao realizar o teste de Hargreaves, concentre o feixe infravermelho sob a área plantar do pé do rato.
- Comece realizando testes de Hargreaves de linha de base antes das injeções para estabelecer um valor de linha de base para comparação.
- Não injete nenhum medicamento de qualquer tipo antes de estabelecer um valor de linha de base. Realize cinco bons testes, com 5 minutos de intervalo. Um bom teste é indicado por uma retirada clara, ou seja, quando o rato dobra o joelho e levanta o pé para cima e para dentro do corpo.
NOTA: Certifique-se de que os testes estejam separados por 5 minutos para evitar a sensibilização do rato. O aparelho de Hargreaves registra automaticamente o tempo de retirada, uma vez que o feixe infravermelho é interrompido. Como resultado, certifique-se de descontar as tentativas de locomoção, mudança de peso, etc. Se ocorrer um teste com desconto, aguarde 5 minutos e repita o teste. - Calcule os limites de retirada tomando a média das cinco tentativas.
- Depois de obter uma média basal, inicie o experimento para obter os tempos de abstinência após a infusão dos medicamentos. Os testes de Hargreaves podem ser realizados 20-30 minutos após as injeções intracranianas, embora o momento preciso possa depender da farmacocinética dos agentes específicos. Isso é para garantir que o rato tenha absorvido a droga e esteja experimentando seus efeitos. Conduza este experimento da mesma maneira que a etapa 3.1.
- Calcule os limites de retirada conforme mencionado na etapa 3.2.
