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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Preparando o animal para a cirurgia
- Realize procedimentos cirúrgicos em um espaço limpo e dedicado. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e esterilize com um esterilizador de esferas de vidro antes da cirurgia.
NOTA: Neste protocolo, use camundongos FVB pós-natal dia 10-12 (P10-12). Diferentes idades e linhagens de camundongos podem ser usadas para atender às necessidades de um projeto específico. Camundongos com mais de P40 podem ser desafiadores porque o osso da bula fica mais duro. - Anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg), cloridrato de xilazina (10 mg / kg) e acepromazina (2 mg / kg). Comece a preparação cirúrgica somente depois que o animal não responder mais a estímulos dolorosos, como beliscar o dedo do pé. Se necessário, administre uma dose de reforço (um quinto da dose original) do coquetel anestésico para restaurar o plano anestésico original.
NOTA: Tome cuidado nesta etapa porque a maior parte da mortalidade observada nessa idade é causada por overdose de anestésico. - Cubra os olhos do animal com uma pomada oftálmica protetora para mantê-los úmidos durante a anestesia, suprimindo o reflexo de piscar do animal.
- Para evitar hipotermia pós-anestésica, posicione o mouse com o pescoço estendido em uma almofada de aquecimento durante todo o procedimento até que esteja totalmente acordado.
- Raspar a região pós-auricular esquerda com um tosquiador e desinfetar com etanol a 70% e iodopovidona antes da manipulação cirúrgica.
2. O procedimento cirúrgico e a injeção de vetor
- Use uma abordagem pós-auricular para expor a bolha timpânica. Incisar o tecido subcutâneo com uma pequena tesoura para expor o músculo pós-auricular. Após retrair o tecido adiposo para o lado posterior da incisão, separe os músculos dos lados direito e esquerdo perpendiculares à incisão para expor o osso temporal. Certifique-se de que esta incisão seja longa o suficiente para funcionar confortavelmente com visualização adequada.
- Perfure a bula timpânica com uma agulha de 25 G e expanda o orifício conforme necessário com uma pinça, descascando o osso para trás para permitir o acesso ao giro basal da cóclea e, em seguida, alargue o suficiente para visualizar a artéria estapedial e a membrana da janela redonda (RWM).
- Perfure o RWM suavemente no centro com uma pipeta capilar de borossilicato. Observe o efluxo de fluido através do RWM neste ponto; Isso é normal. Aguarde até que o efluxo se estabilize (o fluido efluente da cóclea é seco com um papel de filtro estéril).
NOTA: Tome cuidado ao segurar e avançar a agulha de vidro para que a perfuração do RWM seja a menor possível. Dependendo do microscópio utilizado, segure as pipetas com um micromanipulador ou manualmente com um porta-pipetas. - Prepare as pipetas para injeção usando um extrator de pipetas, da mesma forma que as pipetas patch clamp são preparadas. Certifique-se de que o diâmetro da ponta seja grande (cerca de 15 μm de diâmetro) para que a pipetagem do vírus seja feita facilmente.
- Aspirar 1 a 2 μl de vírus adeno-associados (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP) para uma pipeta de injecção. Após a estabilização do efluxo (5 a 10 min), microinjetar esse volume fixo na escala do tímpano através do mesmo orifício feito anteriormente no RWM.