Imagem de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas em um cérebro de camundongo

Resumo

Fonte: Weber, R. Z., et al., Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o método para imagens de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas geneticamente modificadas injetadas em um cérebro de camundongo. O processo envolve injeção de luciferina, preparação de imagens e detecção de sinais bioluminescentes das células transplantadas no local da injeção.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

Imagem in vivo

1. Preparação de luciferina
   1. Descongele o sal de D-luciferina potássica à temperatura ambiente (RT) e prepare uma nova solução de estoque de D-luciferina a 30 mg/mL em PBS.
   2. Esterilize a solução estoque através de um filtro de seringa de 0.22 μm.
      NOTA: Recomenda-se o uso imediato da solução de trabalho. Se necessário, a luciferina dissolvida pode ser armazenada a -20 °C. No entanto, o armazenamento prolongado pode resultar na degradação do sinal. A luciferina é um reagente sensível à luz; mantenha-o longe da luz direta sempre que possível. Substratos alternativos também podem ser considerados, por exemplo, cycluc, para melhorar o limite de resolução.
2. Imaging
   1. Configuração inicial
      NOTA: A imagem de bioluminescência foi realizada usando um sistema de imagem in vivo (consulte a Tabela de Materiais) que consiste em uma câmara escura e uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) resfriada.
      1. Clique duas vezes no ícone do software Live Image e selecione um ID de usuário na lista suspensa.
      2. Clique em Inicializar no painel de controle exibido. Assim que o processo de inicialização for concluído, a caixa de temperatura no painel de controle ficará verde.
      3. No painel de controle, marque as caixas Luminescente e Fotografia e selecione Exposição automática (~60 seg.). Selecione um campo de visão (D/12,5cm foi escolhido para este protocolo). Insira a altura do assunto (1,5 cm) e selecione a opção de foco usar altura do assunto. Defina manualmente os seguintes parâmetros: compartimento grande, f/2, filtro de excitação bloqueado e filtro de emissão aberto.
   2. Determine a quantidade de injeção de D-luciferina a 300 mg/kg de peso corporal.
      NOTA: A dose padrão recomendada é de 150 mg/kg de D-luciferina. Este procedimento foi ajustado de acordo com um protocolo que relata maior sensibilidade usando 300 mg / kg.
   3. Injete a luciferina por via intraperitoneal (i.p.).
      NOTA: Se o animal precisar ser sedado antes da injeção, esteja ciente de que isso pode estender o tempo de pico de expressão da luciferase.
   4. Aguarde 5 minutos e, em seguida, anestesiar os animais com um suprimento contínuo de isoflurano (4,5% na fase de indução e 1,5-2% na fase de manutenção durante o procedimento de imagem).
   5. Aplique lubrificante oftálmico nos olhos e, em seguida, raspe os animais sedados na região da cabeça usando um barbeador de cabelo convencional. Coloque os animais na câmara de imagem e inicie a imagem 15 minutos após a injeção de luciferina clicando em Adquirir no painel de controle.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Consumíveis Filtro de
seringa; 0,22 μm	TPP	99722
Equipamento
Almofada			de aquecimento Produto de escolha
Sistema de imagem In-Vivo (IVIS Lumina III com pacote de software Living Imaging 4.2)	Perkin Elmer	CLS136334
Vaporizador de isoflurano	Provet AG	330724
Produtos farmacêuticos e reagentes
D-Luciferina Sal	de potássioPerkin Elmer	122799
Etanol; 70%			Produto de escolha
Isoflurano (Isofluran (1-Cloro-2,2,2-trifluoretil-difluoroéter 99,9%)	Provet AG	Todos os produtos farmacêuticos foram fornecidos pela farmácia cantonal, Zurique, Suíça
Lubrificante oftálmico (palmitato de retinol: 15.000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	Todos os produtos farmacêuticos foram fornecidos pela farmácia cantonal, Zurique, Suíça