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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Transplante de células intra-hipocampal
NOTA: Todas as etapas desta seção são realizadas fora da cobertura de cultura de células na instalação animal. O transplante pós-natal precoce de células para o cérebro foi realizado em P2, considerando P0 no dia do nascimento.
- Prepare-se para o experimento de transplante seguindo as etapas abaixo.
- Autoclave todo o material cirúrgico ou, se não for possível, esterilize com outro método aprovado.
- Monte a seringa de injeção no suporte sem nenhum capilar de vidro. Enxágue a agulha com água.
NOTA: A agulha deve ter 33 G. - Curva 90° da ponta de uma agulha de insulina de 30 G.
- Crie um palco caseiro semelhante a Play-Doh para posicionar o filhote com a cabeça reta (Figura 1A).
- Pegue a gaiola do rato com a mãe e os filhotes antes de preparar qualquer coisa para a cirurgia para permitir que eles se acostumem ao novo ambiente.
- Prepare uma bandeja com gelo úmido e uma gaiola vazia com um pouco de papel para o isoflurano.
- Anestesifique o filhote de rato.
- Mergulhe um pedaço de papel com isoflurano (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-o dentro da gaiola vazia. Com cuidado, pegue um filhote e coloque-o na gaiola com o papel embebido em isoflurano.
OBS: Nunca deixe menos de três filhotes com a mãe. Não exceda 20-30 s de anestesia com isoflurano, ou o filhote pode morrer. - Verifique o efeito da anestesia pela interrupção do movimento.
- Imediatamente após a anestesia, coloque o filhote em um lenço úmido na superfície do gelo úmido. Mantenha o animal no gelo por 3 min até que os membros superiores fiquem esbranquiçados (Figura 1B, seta azul). Isso geralmente leva de 2 a 3 minutos.
- Use esse tempo para carregar a seringa com a suspensão celular. Ressuspenda as células cuidadosamente com uma pipeta antes.
- Coloque o filhote na estrutura estereotáxica. Use as barras auriculares na direção oposta (Figura 1A, setas magenta).
NOTA: A parte de trás das barras auriculares é menos pontiaguda e, como os filhotes P2 não têm orelhas, use o lado mais plano para evitar machucar o animal. - De lado, verifique se a cabeça está reta. A cabeça deve ser plana; use o estágio do tipo Play-Doh para se ajustar a isso.
NOTA: Os filhotes nessa idade ainda não abriram os olhos, portanto, nenhuma medida adicional precisa ser tomada a esse respeito. Os filhotes não têm pêlo nessa idade, portanto, não é necessário raspar a área. Nenhum tratamento específico para a dor é administrado, pois não é uma incisão aberta na pele e nenhuma sutura está envolvida. - Mantenha o filhote coberto de gelo (em cima de papel de seda) durante toda a cirurgia.
NOTA: Não coloque o gelo em contato direto com a pele do filhote.
- Execute a injeção.
- Limpe a superfície da pele usando um tecido mole embebido em etanol.
- Identifique lambda e defina as coordenadas como zero no console de exibição digital do instrumento estereotáxico (Figura 1C, linha tracejada amarela). As suturas sagitais e lambdoides são facilmente visíveis a olho nu, pois são vascularizadas como linhas vermelhas.
NOTA: Se tiver dificuldades para visualizar lambda, coloque um pequeno pedaço de gelo na pele e espere alguns minutos para que ela esfrie. Em seguida, remova o pedaço de gelo e o clareamento sutil da pele permitirá que você visualize. - Reposicione a agulha de injeção para as coordenadas desejadas. No protocolo descrito, a região alvo foi o hipocampo, e as coordenadas foram as seguintes: ântero-posterior (AP) +0,85 e médio-lateral (ML) +1,35.
- Use uma agulha de insulina dobrada a 90 ° para penetrar no crânio e criar um pequeno orifício.
- Abaixe a agulha de injeção até que ela atravesse o crânio e zere as coordenadas dorso-ventrais (DV). Abaixe a agulha até as coordenadas DV desejadas. No protocolo descrito, as coordenadas foram DV −1,1.
- Injetar de acordo com os intervalos de tempo pré-determinados.
OBS: No protocolo descrito, os tempos exatos foram os seguintes: (i) após descer até a coordenada DV, aguardar 3 min, (ii) injetar 1 μL de volume por 5 min, e (iii) após todo o volume ter sido injetado, aguardar 3 min. - Retraia a agulha lentamente.
- Finalize o procedimento.
NOTA: A cirurgia não pode durar mais de 15 min para garantir a sobrevivência do filhote e evitar qualquer dano derivado da anestesia por hipotermia. - Aqueça o filhote com as mãos até que ele comece a se mover antes de devolvê-lo à mãe.
- Administre DOX na concentração de 1 mg / mL em solução de sacarose a 0,5% como água potável por pelo menos 2 dias antes e 3 semanas após o transplante (PT) para continuar a diferenciação celular in vivo.
