Transferência de genes assistida por eletroporação incorporada em agarose em progenitores de interneurônios corticais de camundongos

1. Focal DNA injections
   1. Prepare uma mistura de ácido desoxirribonucléico (DNA) de vetores de expressão: pCAGGs-IRES-GFP (vetor de controle) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a uma concentração de 1 μg/μL para cada vetor. Adicionar solução verde rápida (25 mg/ml reserva) numa diluição de 1/10.
   2. Encha uma micropipeta de vidro puxado (0,5 mm de diâmetro interno e 1 mm de diâmetro externo) com 10 μL da mistura de DNA e injete pequenas quantidades (na faixa de 25-50 nL) na região selecionada (Eminência Ganglionar Medial ou MGE / Ganglionar Caudal ou CGE) da fatia (Figura 1 e Figura 2).
2. Eletroporação aguda
   NOTA: A eletroporação deve ser realizada imediatamente após a injeção focal de DNA.
   1. Coloque o pequeno bloco de agarose no eletrodo da placa de Petri e prenda a coluna de agarose ao eletrodo de cobertura móvel usando uma microespátula de extremidade plana.
   2. Transfira a fatia com sua membrana de suporte para o bloco de agarose e coloque o eletrodo superior com a coluna de agarose no topo da região selecionada (MGE/CGE) da fatia.
      NOTA: Vol de cargatages de 125 V (dois pulsos de 5 ms cada, intervalo de 500 ms) produzirão uma eletroporação bem-sucedida (Figura 3).
3. Após a eletroporação, colocar a fatia com a sua membrana de suporte na cápsula e transferi-la para uma incubadora de cultura de tecidos de CO₂ a 37 °C.

Figura 1: Fatias teleencefálicas representativas usadas para experimentos de eletroporação aguda. (AC) Cortes telencéfalos foram obtidos em três níveis rostrocaudal sequenciais distintos, corados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). LGE: eminência ganglionar lateral; EMG: eminência ganglionar medial; CGE: eminência ganglionar caudal. Barras de escala = 200 μm. Os asteriscos amarelos indicam o local de eletroporação em cada fatia. A linha branca marca a borda da eminência ganglionar.

Figura 2: Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. (A) Fatias de cérebro de camundongo são eletroporadas com construções apropriadas, e (B) após 12 h, precursores de interneurônios corticais (IC) modificados são isolados e (C) transplantados no pálio de filhotes de camundongos recém-nascidos (P0−P2). Com o objetivo de modificar a atividade dos ICs imaturos, filhotes P14 que receberam transplantes celulares foram injetados com CNO ou veículo por quatro dias constitutivos de acordo com o protocolo apresentado. (A') Fotografia da configuração de eletroporação aguda de fatia de cérebro de camundongo.

Figura 3: Experimento de eletroporação de corte agudo bem-sucedido representativo. (A) Corte coronal representativo de um cérebro embrionário E14.5 transfectado no CGE com plasmídeos pCAGGs-IRES-GFP (proteína fluorescente verde) e pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (proteína fluorescente vermelha) e cultivado por 12 h. A seção foi imunomarcada para GFP (A, B, C) e RFP (A, B, D). A área encaixotada no painel A é ampliada para mostrar a expressão de repórteres fluorescentes (B), GFP (C) e RFP apenas (D). A linha branca marca a borda da eminência ganglionar. BD: mesma foto, canais diferentes ou uma combinação dos dois canais diferentes. Barras de escala = 200 μm (A), 100 μm (B-D).