Transferência de genes assistida por eletroporação incorporada em agarose em progenitores de interneurônios corticais de camundongos

Resumo

Fonte: Denaxa, M., el al., Transplante de progenitores de interneurônios corticais quimiogeneticamente modificados em cérebros de camundongos pós-natais precoces. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento para injetar um vetor de plasmídeo carregando o gene de interesse em progenitores interneurônios em uma fatia de cérebro embrionário, seguido de eletroporação para entrada de plasmídeo e expressão gênica. Esses progenitores modificados podem ser usados posteriormente para o tratamento de distúrbios cerebrais.

Protocolo

1. Focal DNA injections
   1. Prepare uma mistura de ácido desoxirribonucléico (DNA) de vetores de expressão: pCAGGs-IRES-GFP (vetor de controle) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a uma concentração de 1 μg/μL para cada vetor. Adicionar solução verde rápida (25 mg/ml reserva) numa diluição de 1/10.
   2. Encha uma micropipeta de vidro puxado (0,5 mm de diâmetro interno e 1 mm de diâmetro externo) com 10 μL da mistura de DNA e injete pequenas quantidades (na faixa de 25-50 nL) na região selecionada (Eminência Ganglionar Medial ou MGE / Ganglionar Caudal ou CGE) da fatia (Figura 1 e Figura 2).
2. Eletroporação aguda
   NOTA: A eletroporação deve ser realizada imediatamente após a injeção focal de DNA.
   1. Coloque o pequeno bloco de agarose no eletrodo da placa de Petri e prenda a coluna de agarose ao eletrodo de cobertura móvel usando uma microespátula de extremidade plana.
   2. Transfira a fatia com sua membrana de suporte para o bloco de agarose e coloque o eletrodo superior com a coluna de agarose no topo da região selecionada (MGE/CGE) da fatia.
      NOTA: Vol de cargatages de 125 V (dois pulsos de 5 ms cada, intervalo de 500 ms) produzirão uma eletroporação bem-sucedida (Figura 3).
3. Após a eletroporação, colocar a fatia com a sua membrana de suporte na cápsula e transferi-la para uma incubadora de cultura de tecidos de CO₂ a 37 °C.

Resultados

Figura 1: Fatias teleencefálicas representativas usadas para experimentos de eletroporação aguda. (AC) Cortes telencéfalos foram obtidos em três níveis rostrocaudal sequenciais distintos, corados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). LGE: eminência gangliona...

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