Injetando vetores adeno-associados recombinantes em um modelo de camundongo com atrofia muscular espinhal e bulbar

Resumo

Fonte:
Pourshafie, N., et al. Entrega sistêmica de microRNA usando vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores. J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, uma atrofia muscular espinhal e bulbar ou camundongo afetado por SBMA é submetido à injeção na veia da cauda de vetores AAV (vetores adeno-associados) recombinantes que carregam um plasmídeo que codifica microRNA terapêutico. O vetor produz microRNA que se liga ao AR mutante (receptor de andrógeno)-mRNA (ácido ribonucléico mensageiro), desencadeando sua degradação. Isso reduz o acúmulo de proteínas tóxicas e ajuda a melhorar a função neuromuscular.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeção na veia da cauda do plasmídeo AAV-miRNA

NOTA: Esta etapa precisa ser ajustada de acordo com o gene alvo e a idade e peso dos camundongos. Use as diretrizes do Comitê Institucional e de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para determinar a faixa de dose, o volume e a melhor via de administração com base na idade e no peso dos camundongos. Espera-se que o sinal de fluorescência GFP (proteína fluorescente verde) e os níveis de expressão de miRNA nos tecidos-alvo atinjam o pico a partir de 2 semanas após a injeção. O protocolo a seguir refere-se a camundongos machos no início da idade adulta. O AAV deve ser tratado como um risco biológico de acordo com as diretrizes de Nível 1 de Biossegurança.

1. Divida o estoque de plasmídeo AAV-miRNA em alíquotas de 100-200 μL contendo uma carga viral de 10^{10-10 11} genomas virais por mL (vg / mL) usando solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Equipamento de proteção individual de risco biológico de laboratório deve ser usado para manusear a solução de AAV.
   NOTA: Uma vez descongelada, uma alíquota pode ser armazenada a 4 °C por até duas semanas. O estoque viral pode ser armazenado em freezer a -80 °C.
2. Restrinja o mouse em sistemas de retenção disponíveis comercialmente, como plástico ou tubo de filme plástico cônico de tamanho adequado.
3. Limpe a superfície da cauda com lenços umedecidos com álcool 70%.
4. Segure uma almofada quente (28-30 °C) sob a cauda por 30 segundos para aumentar a vasodilatação. Como alternativa, aqueça os animais usando uma lâmpada de calor vermelha (a uma distância de 2-3 pés) ou mergulhando a cauda em água morna.
5. Começando pela porção distal da cauda, insira a agulha (27-30 G) carregada com a alíquota viral, incline para cima, 15° da cauda, na veia. Antes da injeção, certifique-se de que a agulha está inserida corretamente.
   1. Se sentir resistência durante a injeção ou aparecer inchaço sob a pele, interrompa o procedimento. Remova a agulha e insira-a novamente acima do local da injeção anterior.
      NOTA: Alternativamente, isso pode ser conseguido aspirando suavemente a agulha e observando o sangue. A aspiração forte pode colapsar a veia da cauda. Se a veia branquear durante a injeção, a agulha é inserida corretamente.
6. Após a conclusão da injeção, aguarde alguns segundos antes de levantar a agulha.
7. Observe o local da injeção quanto a sangramento. Aplique pressão moderada usando dois dedos no local até que o sangramento pare.
8. Devolva o animal à sua gaiola.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Scale	Pelouze	SP5
Balde Nalgene Thermo	Scientific	12014000	4000 mL
Tubo de microcentrífuga	USA Scientific	1615-5500
Ringer's lactato Solução	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vórtice	Centrífuga 128101
	Eppendorf	22624415
Filme de laboratório	Bemis	PM996
Seringa de 1 mL	BD	309626	Vem com uma agulha de 25g acoplada. Substitua por agulha de 27-30g para injeção
agulha de 30g	BD	305106
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurano USP 250 mL
Máscara de anestesia	Kopf Instruments	906
Gaze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pontas de pipeta	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Vaporizador de anestesia a gás	SurgiVet	4214322	Classic T3
Sequestrante de anestesia a gás	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Almofada de aquecimento	Sears	17280
Almofada de bancada	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ Aparelho Harvard	76-0772	4 ratos / 4 camundongos
70% Etanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 prova
70% Isopropanol	VWR	89108-160

Fisher Scientific