Injeção intracraniana de metabólitos microbianos derivados do intestino em um modelo de camundongo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação para o animal experimental

1. Obtenha camundongos machos C57BL/6JNarl do tipo selvagem de 6 a 8 semanas de idade de um fornecedor.
2. Aloje os ratos em uma gaiola de rato padrão com ração padrão e água esterilizada ad libitum.
   NOTA: As condições de alojamento para o Centro de Animais de Laboratório são de 22 ± 1 °C de temperatura, 55% ± 10% de umidade e um ciclo claro/escuro de 13 h/11 h.

2. Cirurgia estereotáxica

1. Prepare e esterilize o instrumento estereotáxico, instrumentos cirúrgicos e itens relacionados.
   NOTA: Todos os itens que entrarão em contato direto com o local da cirurgia devem ser esterilizados para evitar infecção.
2. Anestesie o mouse colocando-o na gaiola de acrílico com 1% a 5% de isoflurano em oxigênio.
   NOTA: Observe atentamente o mouse para garantir que a taxa de respiração seja mantida em torno de uma respiração por segundo.
3. Retire o mouse da câmara de anestesia. Raspe o local da cirurgia (cabeça do rato) com um aparador de animais de estimação. Coloque o mouse na estrutura estereotáxica, fixando os incisivos do mouse na barra incisiva no suporte do incisivo estereotáxico. Cubra o nariz com a máscara do nariz.
4. Anestesiar o camundongo com 1% -2,5% de isoflurano em oxigênio durante toda a cirurgia estereotáxica. Avalie a nocicepção do camundongo por meio do reflexo de pinça do dedo do pé e garanta uma frequência respiratória constante antes de incisar o local da cirurgia.
5. Coloque uma almofada de aquecimento (37,0 °C) embaixo do mouse na estrutura estereotáxica para manter a temperatura corporal durante a cirurgia. Em alternativa, mantenha a temperatura central com a ajuda de uma sonda térmica retal que liga o aquecedor programado e a almofada de aquecimento.
6. Remova o pelo aparado da cabeça usando fita adesiva. Injete no camundongo o analgésico cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea para aliviar a dor. Aplique pomada para os olhos para evitar olhos secos.
7. Insira a barra de orelha pontiaguda no canal auditivo para fixar a cabeça.
8. Centralize a cabeça ajustando a escala da barra auricular.
9. Aperte o grampo do nariz no suporte do incisivo para evitar movimento vertical. Pressione a cabeça suavemente para verificar se a cabeça está fixa e evitar que a cabeça se solte durante a cirurgia subsequente.
10. Desinfete o couro cabeludo com três esfoliações alternadas de clorexidina usando um cotonete. Comece cada esfoliação do meio para o lado externo (da área central mais desinfetada para a área menos desinfetada).
    NOTA: O uso de esfoliantes do meio para o exterior pode ajudar os cientistas a minimizar a infecção e a contaminação do pelo. A área externa fica próxima à região da cabeça não raspada, que ainda tem uma grande quantidade de pelos e não é fácil de desinfetar completamente.
11. Incisar o couro cabeludo de forma anterior/posterior (<1 cm) com lâmina cirúrgica. abra a incisão e limpe o crânio um cotonete segurado por uma pinça de microdissecação.
    NOTA: A pinça de microdissecação, a lâmina cirúrgica e os cotonetes devem ser esterilizados em autoclavagem antes da cirurgia. Durante o processo cirúrgico, esterilize todo o equipamento cirúrgico usando um esterilizador de esferas de vidro (150 °C) por pelo menos 5 s antes e depois de cada animal. Prepare um béquer esterilizado para segurar a lâmina cirúrgica e a pinça durante o processo cirúrgico e entre os animais.
12. Identifique o Bregma e o Lambda no crânio. Use o Bregma como referência para localizar a região de interesse.
    1. Opcional: Monte a broca estereotáxica no suporte da broca estereotáxica e use a ponta da broca para apontar Bregma como referência. Esterilize a broca estereotáxica usando o esterilizador de esferas de vidro (150 °C) por pelo menos 5 s.
13. Calibre e alinhe o plano horizontal do crânio nos planos esquerdo/direito e anterior/posterior por Bregma/Lambda.
    NOTA: Se não estiver em um plano horizontal correto, remonte o mouse no instrumento estereotáxico.

3. Implante de cânula guia personalizada comercial

1. Identifique e rotule a posição do ventrículo lateral direito com base nas coordenadas estereotáxicas: Distância até Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm.
   NOTA: As coordenadas podem ser modificadas com base na região de interesse. As coordenadas para o ventrículo lateral foram baseadas em camundongos C57BL/6J adultos com uma faixa de peso de 26-30 g.
2. Faça um furo (diâmetro = 1,5 mm) através do crânio no local rotulado usando uma broca estereotáxica para a implantação de uma cânula guia comercial.
3. Faça mais dois a quatro furos (diâmetro = 1.5 mm) no crânio usando uma broca estereotáxica para a montagem de parafusos de aço inoxidável.
   NOTA: Esterilize a broca estereotáxica usando um esterilizador de esferas de vidro (150 °C) por pelo menos 5 s antes e depois de cada animal.
4. Limpe os restos de ossos e pare de sangrar com um cotonete.
5. Limpe o crânio com lidocaína (1 mg / kg) usando um cotonete para efeitos anestésicos locais, antipruriginosos e analgésicos. Se o sangramento não parar após a perfuração, coloque suavemente um cotonete no orifício para hemostasia.
6. Monte dois a quatro parafusos de aço inoxidável nos orifícios para fornecer âncoras para acrílico dental.
7. Coloque a cânula guia comercial no suporte da cânula estereotáxica e desinfete-a com o esterilizador de esferas de vidro (150 °C).
   NOTA: A cânula guia comercial, o manequim comercial e o injetor comercial (Figura 1A) foram personalizados com as especificações mostradas na Tabela de Materiais.
8. Mova o suporte da cânula estereotáxica para o orifício perfurado para o ventrículo lateral e insira lentamente a cânula guia comercial no orifício até a profundidade desejada (2,5 mm).
   NOTA: A coordenada dorsal/ventral pode ser definida definindo a ponta da cânula guia comercial como referência quando a ponta mal estiver inserida no orifício.
9. Aplique 10 μL de adesivo de n-butil cianoacrilato (cola adesiva tecidual) para fixar a cânula guia comercial no orifício perfurado e aguarde 3-4 min. Solte a cânula guia comercial suavemente do suporte da cânula estereotáxica e afaste o suporte.
10. Aplique o acrílico dentário no couro cabeludo incisado para fixar a cânula guia comercial e aguarde pelo menos 5 min. Implante o manequim comercial na cânula guia comercial para evitar o entupimento da cânula por sangue ou fluido corporal (Figura 1B).
11. Solte a barra auricular do canal auditivo e remova o mouse da estrutura estereotáxica.
12. Coloque o mouse em uma nova gaiola com uma almofada de aquecimento embaixo para recuperação da anestesia e observe continuamente até que o mouse desperte completamente.
    NOTA: Não deixe o animal sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Um animal que tenha sido submetido a uma cirurgia não deve retornar à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
13. Retorne o camundongo para um alojamento individual ou em grupo, dependendo do protocolo do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e do projeto experimental. Para alojamento em grupo, certifique-se de que menos ratos sejam alojados em uma gaiola para minimizar lesões indesejadas ou o descolamento da cânula.
14. Administre ibuprofeno (0,2 mg / mL) na água potável por pelo menos 3 dias para cuidados pós-operatórios e monitore duas vezes ao dia quanto a sinais de dor e angústia por pelo menos 3 dias.
    1. Durante os cuidados pós-operatórios, aplique pomada de roxitromicina ao redor da pele para prevenir inflamação e infecção nos camundongos.
    2. Continue monitorando o estado do animal e administre uma injeção intraperitoneal oportuna de glicose a 5% e/ou cloreto de sódio a 0,9% para fornecer energia suficiente.
    3. Se o estado de dor, angústia ou infecção se deteriorar constantemente, eutanasiar o camundongo por inalação de CO₂.
15. Aguarde 1 semana após a operação para que o camundongo esteja pronto para a administração intracerebroventricular de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) e testes comportamentais.

4. Preparação de AGCC

1. Dissolva o acetato de sódio, o butirato de sódio e o propionato de sódio no líquido cefalorraquidiano artificial (FCSCA) (consulte a Tabela de Materiais).
2. Certifique-se de que os produtos químicos estejam totalmente dissolvidos, ajuste o pH para 7,4 e filtre a mistura de SCFAs através de um filtro de 0,22 μm para esterilização.

5. Configure o sistema de infusão para administração intracerebroventricular de SCFAs durante o teste comportamental

1. Monte uma câmera de teto para registrar o comportamento. Conecte a câmera a um computador para controlar o software de gravação de vídeo (Figura 2).
2. Encha uma seringa de 10 μL com água destilada.
   NOTA: Evite bolhas de ar na seringa de microlitro.
3. Conecte uma bomba de microinjeção ao controlador de microinjeção.
4. Monte a seringa de microlitro na bomba de microinjeção. Para instalar a seringa, pressione o botão para soltar o clamp e instale a seringa na posição correspondente. Feche o clamp e aperte o parafuso de retenção do êmbolo na bomba de microinjeção (Figura 3A).
5. Insira o injetor comercial no tubo de polietileno (Figura 1A).
6. Pendure o tubo de polietileno na câmera do teto acima da arena de teste.
7. Encha o tubo de polietileno com água destilada usando uma seringa de insulina. Conecte a seringa de microlitro ao tubo de polietileno suspenso.
   NOTA: Certifique-se de que o tubo de polietileno seja longo o suficiente para permitir que o mouse se mova livremente pela arena de teste.

6. Configurações do sistema do controlador de microinjeção

1. Ligue o controlador de microinjeção e pressione Exibir todos os canais para acessar a tela de comando (Figura 3C). Pressione Configuração e defina a Meta de Volume para 9.800 nL com a Taxa de Entrega para 100 nL/s. Infundir 9.800 nL de água destilada do tubo de polietileno conectado à seringa de microlitro (pressione Direção para alternar para o modo Infundir e pressione RUN) (veja os quadrados vermelhos na tela de comando da Figura 3C).
2. Pressione Configuração e defina a Meta de Volume para 3.000 nL com Taxa de Entrega para 100 nL/s. Retire 3.000 nL de óleo mineral (pressione Direção para alternar para o modo Retirar e pressione RUN) (veja os quadrados vermelhos na tela de Comando da Figura 3C).
   NOTA: Uma separação clara das fases óleo-água deve ser observada no tubo de polietileno.
3. Desmonte o tubo de polietileno da agulha da seringa de microlitros. Cuspa 3.000 nL de água destilada da agulha da seringa de microlitro (pressione Direção para alternar para o modo Infundir e pressione RUN).
4. Insira a seringa de microlitro de volta no tubo de polietileno. Pressione Configuração e defina a Meta de volume para 9.500 nL com uma taxa de entrega de 100 nL/s. Retire 9.500 nL de SCFAs (pressione Direção para alternar para o modo Retirar e pressione EXECUTAR). Rotule a fase óleo-SCFAs para validar se os SCFAs foram infundidos com sucesso.
5. Pressione Configuração e defina a meta de volume desejada com taxa de entrega para 7 nL/s. Pressione Direção para alternar para o modo de infusão (consulte os quadrados vermelhos na tela de comando da Figura 3C).
   NOTA: Determine o volume com base no tempo de infusão. Por exemplo, se o tempo de infusão for de 3 min para a taxa de entrega de 7 nL/s, volume alvo = 1.260 nL.
6. Pressione RUN para infundir a seringa de microlitro para frente até que o líquido saia pela extremidade frontal do injetor comercial antes de inserir o injetor na cânula para injeção de SCFAs.

7. Infusão de AGCC no ventrículo lateral através da cânula guia comercial em um camundongo em movimento livre

1. Anestesie o camundongo colocando-o na gaiola de acrílico com 1%-5% de isoflurano em oxigênio.
   NOTA: Observe atentamente o camundongo para garantir que a frequência respiratória seja mantida em torno de uma respiração por segundo.
2. Limpe o mouse e insira o injetor comercial na cânula guia comercial (Figura 3B).
   NOTA: Se a cânula guia comercial estiver obstruída por sangue ou fluido corporal, desobstrua-a suavemente com uma pinça.
3. Permita que o camundongo se recupere da anestesia por 15 minutos em uma gaiola antes do teste comportamental.
4. Para o teste básico de locomoção, coloque o mouse em uma nova gaiola e deixe-o explorar livremente por 35 min. Infundir SCFAs usando uma taxa de entrega de 7 nL/s para um volume alvo de 2.100 nL nos primeiros 5 min (pressione Direção para o modo Infuse e pressione RUN).
   NOTA: A locomoção na nova gaiola pode ser analisada usando o software de rastreamento de vídeo de comportamento animal.
5. Anestesiar o mouse (repetindo a etapa 7.1) e remover o injetor comercial da cânula guia comercial.
   NOTA: O camundongo pode ser injetado repetidamente com diferentes controles/metabólitos após dar o período de tempo apropriado para lavar a injeção anterior. Enquanto a cânula estiver fixada na cabeça do camundongo, o camundongo pode ser testado repetidamente com diferentes metabólitos.

8. Restauração do sistema de microinjeção

1. Desmonte o tubo de polietileno da seringa de microlitro.
2. Injete ar no tubo usando a seringa de insulina para descartar a água destilada no tubo de polietileno. Esvazie a seringa de microlitros.
3. Pressione Reset Pos na tela Configuração para abrir a tela Definição da Figura de Parada da Seringa (Figura 3C).
4. Pressione Retirar até que ocorra um bipe para redefinir a bomba de microinjeção para a posição totalmente retirada (Figura 3C).
5. Retorne à tela Comando e desligue o controlador de microinjeção se houver um sinal **END REACHED** nesta tela (Figura 3C).

Figura 1: Implantação da cânula guia comercial em camundongos. (A) A imagem representativa de uma cânula guia comercial, manequim e injetor. (B) A imagem representativa de uma cânula guia comercial e manequim implantada no cérebro de camundongos por fixação com acrílico dentário.

Figura 2: O equipamento de infusão intracerebroventricular para testes de comportamento. O diagrama do sistema de microinjeção, sistema de gravação de vídeo e aparelho comportamental. Abreviatura: SCFAs = ácidos graxos de cadeia curta.

Figura 3: O sistema de microinjeção. (A) A instalação da seringa de microlitro usando uma bomba de microinjeção. (B) A inserção do injetor comercial conectado com um tubo de polietileno na cânula guia comercial (C). A tela sensível ao toque do controlador de microinjeção.