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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Preparação Animal
Nota: Animais que serão submetidos a ferimentos leves requerem adaptação ao escuro na noite anterior à isquemia remota. Animais submetidos a danos causados pela luz requerem criação no escuro (12 horas de luz: ciclo escuro, 5 lux)
- Realizar isquemia remota em roedores acordados ou anestesiados. Certifique-se de que os animais tenham um tônus muscular saudável. Certifique-se disso beliscando o membro posterior superior para confirmar se há músculo adequado presente. A proteção induzida por RIP contra lesões leves foi testada em ratos sedentários de até 6 meses de idade.
- Preparação anestesiada para pré-condicionamento isquêmico remoto (RIP)
- Injetar ratos com uma injeção intraperitoneal de 60 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina. Verifique a profundidade da anestesia estendendo a perna e beliscando a pele na parte inferior do pé. O animal não tem reflexo se estiver profundamente anestesiado. Aplique lágrimas artificiais para evitar o ressecamento da córnea enquanto estiver sob anestesia.
- Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento ou em um tubo de aquecimento de água circulante para manter uma temperatura corporal constante de 37,5 °C. Posicione o rato em decúbito ventral com as almofadas dos pés dos membros inferiores voltadas para cima. Tanto o membro direito quanto o esquerdo podem sofrer isquemia remota.
2. Aplicação da sonda de temperatura da pele
- Estenda a perna do rato que deve ser submetida à isquemia e coloque a sonda de pele na almofada do pé. Posicione a sonda de pele para maximizar o contato entre a sonda de temperatura e a pele. Empurre firmemente a sonda na almofada do pé e fixe a sonda com fita de papel.
- Verifique o posicionamento da sonda de pele rastreando a temperatura no software de registro de temperatura. Certifique-se de que a temperatura da pele esteja entre 30-34 °C e permaneça estável. Acompanhe a temperatura da pele por 1-2 min. Ajuste a sonda cutânea se a temperatura for instável ou inferior a 30 °C.
3. Isquemia Remota
- Esvazie o manguito e certifique-se de que a válvula de pressão de ar esteja fechada. Estenda a perna e envolva frouxamente o manguito no membro posterior superior. Use o indicador e o polegar para estender a perna e os dedos inferiores para manter o manguito solto na posição.
- Aumente a pressão do manguito do animal anestesiado para 160 mmHg e, em animais acordados, aumente a pressão do manguito para 180 mmHg.
Nota: A pressão arterial anestesiada de ratos varia de 120-140 mmHg e sobe para 160 mmHg quando conscientes. Inicie os registros do temporizador e da temperatura do pé assim que a pressão correta for atingida.
Nota: A temperatura do pé deve cair 2 °C após 5 min de pressão constante. - Mantenha a posição do manguito acima do "joelho" do animal durante toda a isquemia. A pressão do manguito começará a cair após alguns minutos ou se o membro do rato estiver se movendo.
- Bombeie repetidamente o bulbo de inflação em rajadas curtas para manter a pressão desejada rajadas curtas repetitivas de bombeamento A
- isquemia remota pode ser administrada continuamente por 5 a 15 min. O protocolo de isquemia e reperfusão inclui 2 períodos de isquemia de 5 minutos com uma reperfusão intermediária de 5 minutos.
- Esvazie a pressão do manguito afrouxando a válvula de pressão de ar. Verifique a mudança de temperatura ao longo do protocolo de isquemia. Solte o manguito.
- Continue com a experimentação de lesões. Animais sob o efeito da anestesia precisarão ser colocados em uma almofada térmica. Continue a monitorar os animais até o ambulatório. Os animais não podem ser devolvidos ao alojamento até que sejam caminhados.