Conduítes semeados de células de Schwann para regeneração axonal após lesão medular

Neste artigo

Resumo

Fonte: Lee, Y., et.al. Transplante de células de Schwann dentro de condutos PVDF-TrFE para construir uma ponte sobre cotos de medula espinhal de ratos seccionados para promover a regeneração do axônio através da lacuna. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o uso de um conduíte de polímero piezoelétrico semeado com células de Schwann para promover a regeneração do axônio em uma medula espinhal de rato seccionada. O conduíte fornece orientação estrutural, enquanto suas propriedades bioelétricas estimulam o crescimento de neuritos. As células de Schwann dentro do conduto secretam fatores neurotróficos, apoiando a ponte axonal entre os cotos rostral e caudal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Transecção em T8

Coloque o retrator em torno de T7 a T9. Depois que todas as lâminas forem removidas, certifique-se de que as lacunas entre os processos transversos sejam visíveis, especialmente em T8. Examine também os ossos ao longo do comprimento em ambos os lados entre T7 e T9 para garantir que não haja fragmentos ósseos projetando-se para fora.
NOTA: Essa lacuna em T8 é importante para realizar a transecção completa. As vértebras ao longo do comprimento devem ser removidas para facilitar a inserção do conduto.
Corte as raízes dorsal e ventral acima e abaixo de T8 usando uma tesoura de mola angular. Adicione solução salina à medula espinhal e espere o sangue coagular.
NOTA: Esta etapa é importante para a inserção adequada do conduto.
Coloque a tesoura de mola angular acima da medula espinhal nos espaços entre os processos transversos em T8 e faça um corte para cortar completamente a medula espinhal. Coloque um pequeno pedaço de espuma comprimida na lacuna resultante de 2-2,5 mm e adicione solução salina à área imediatamente.

2. Inserção de conduíte

Enquanto espera que os tocos de cordão cortados atinjam a hemostasia, retire um conduíte de 1x PBS. Corte os triângulos de absorção em pedaços longos e finos e coloque-os no conduíte para remover o excesso de PBS. Verifique se as janelas pré-cortadas estão abertas.
Remova a solução salina e o sangue usando pedaços longos e finos de triângulos de absorção. Levante os dois cotos da medula espinhal usando uma microespátula para garantir uma boa separação. Levante suavemente o coto rostral com a microespátula e deslize o conduíte sobre o coto com as janelas voltadas para si mesmo. Certifique-se de que todo o coto esteja inserido e que não haja sangramento excessivo no conduíte.
Levante suavemente o coto caudal e deslize a outra extremidade do conduíte sobre o coto. Certifique-se de que todo o coto esteja inserido e as janelas estejam na superfície dorsal (Figura 1A).

3. Célula de Schwann (SC) / Preparação e Injeção de Matriz Injetável

Enquanto espera que o cordão cortado atinja a hemostasia, remova o meio acima do pellet GFP-SC. Ressuspenda as GFP-SCs em 10 μl de DMEM/F12 frio. Adicione 10 μl de gel injetável frio à suspensão celular e misture bem por pipetagem repetida. Mantenha a mistura de matriz GFP-SC/DMEM/F12/injetável no gelo até que a inserção do conduíte seja concluída.
Depois de se certificar de que as janelas na superfície dorsal estão abertas (Figura 1A), injete 20 μl da mistura de matriz GFP-SC / DMEM / F12 / injetável no conduíte através de uma das janelas pré-cortadas usando uma ponta de carregamento de western blot e uma micropipeta. Se a mistura SC/DMEM/F12/matriz injetável encher demais o conduíte, remova o excesso com triângulos de absorção. Feche as janelas após a injeção; não é necessária sutura (Figura 1B).

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Resultados

Figura 1: Fechamento da janela após injeção de SC/DMEM/F12/matriz. As janelas são abertas dobrando cada aba para trás após colocar o conduíte entre os cotos rostral e caudal (A). As janelas são fechadas após a injeção (B...