Espectroscopia Raman anti-Stokes coerente para visualizar neurônios mielinizados no tecido cerebral de camundongos

Resumo

Fonte: McCullagh, E. A., et al. Aplicação de Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS) para mielinização de imagem em fatias de cérebro. J. Vis. Exp. (2022)

O vídeo demonstra imagens de fluorescência e espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) para visualizar a arquitetura neuronal no tecido cerebral de roedores. A coloração de Nissl marca os corpos celulares ligando-se ao RNA ribossômico, enquanto a imagem CARS tem como alvo a mielina rica em lipídios por meio de sinais induzidos por laser. A sobreposição das imagens de fluorescência e CARS fornece uma visão detalhada dos corpos celulares e axônios mielinizados.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Coloração

1. de seções flutuantes livres de manchas para Nissl, para visualizar corpos celulares (1:100), em meio de anticorpos (meio AB: tampão fosfato 0,1 M (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% de albumina de soro bovino (BSA)) por 30 min à temperatura ambiente em um agitador de laboratório padrão.
   1. Proteja as seções da luz usando papel alumínio e/ou uma tampa. Comprimentos de onda de 550 nm ou abaixo são compatíveis com imagens CARS (Figura 1).
      NOTA: Embora não esperemos que o Triton-X ou outros reagentes tenham impacto na imagem CARS de lipídios, controles adicionais com meios de anticorpos específicos podem ser necessários.
2. PONTO DE PAUSA: Armazene seções flutuantes (protegidas da luz) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até a imagem. Uma vez seccionado, faça a imagem das seções cerebrais dentro de 2 semanas.

2. Nota de imagem

: A configuração do laser CARS contém um laser de fibra que fornece o clock de 80 MHz e um laser OPO (Oscilador Paramétrico Óptico) com uma faixa ajustável de 770-990 nm com o feixe de Stokes fixado em 1031 nm, que são necessários para coletar o sinal CARS. Há uma abertura para ambos os feixes.

1. Antes de levar as amostras ao microscópio, ligue e aqueça o laser CARS por pelo menos 1 h, alinhe o laser CARS e Koehler a óptica do condensador e o diafragma do microscópio para imagens CARS diretas.NOTA: Esta etapa é crítica para o funcionamento adequado da microscopia CARS.
   1. Para alinhamento espacial dos dois feixes de laser (bomba e stokes), acesse os dois PSDs internos (detectores sensíveis à posição) através da GUI do laser CARS (interface gráfica do usuário).
   2. Obtenha o alinhamento temporal usando a função de atraso na GUI do laser CARS, que pode ajudar a sobrepor os pulsos dos dois lasers (bomba e stokes) que têm dispersões diferentes devido aos seus diferentes comprimentos de onda. Portanto, tanto a sobreposição temporal quanto a espacial da bomba e dos feixes de stokes são feitas com a entrada do usuário através da GUI.
   3. Ajuste o periscópio externo (dois últimos espelhos da configuração) para centralizar os dois lasers espacialmente sobrepostos nos espelhos da cabeça de varredura do microscópio.
   4. Para melhor detecção direta de CARS não digitalizada, certifique-se de que o condensador seja Koehler (o que significa que o condensador está centralizado e focado no diafragma para obter uma iluminação uniforme)
2. Para imagens confocais de imunofluorescência e imagens CARS, ajuste o laser CARS, com detectores não digitalizados (NDDs) CARS diretos e epi, incorporando um microscópio confocal equipado com lasers visíveis para imagens de fluorescência (Figura 2).
3. Coloque as seções em uma placa de cultura com lamínula (para microscopia invertida), PBS para evitar que o tecido seque e um peso de vidro para manter o tecido próximo à lamínula.
4. Tire z-stacks ou imagens únicas com uma objetiva de água corrigida por infravermelho de 60X, 1,2 abertura numérica (NA), que serve para coleta do sinal CARS na direção epi e através de um condensador de 0,55 NA na direção direta para imagens de áreas cerebrais, como o núcleo medial do corpo trapezoidal (MNTB).
   1. Tire as imagens do CARS em aproximadamente 600 mW bomba/sonda e 300 mW Stokes, usando a GUI do laser CARS. Esses valores de potência do laser são medidos internamente pelo sistema. As potências de ambos os lasers no local da amostra são inferiores a 25 mW e seguras para a amostra de tecido.
   2. Sobreponha a bomba e as vigas Stokes espacial e temporalmente. Ajuste o OPO para 797.2 nm. Isso produz um comprimento de onda CARS de 650 nm. Por causa do nível de energia mais alto, o retorno resultante ao estado fundamental é anti-Stokes (azul deslocado) para a excitação.
   3. Capture o sinal CARS em detectores epi ou diretos não escaneados usando filtros passa-banda (640-680 nm) seguidos de detecção sequencial do marcador de imunofluorescência (neste caso, Nissl marcado com fluorescência). nota: O marcador de soma neuronal de Nissl não é detectado no filtro passa-banda CARS 640-680 nm, permitindo a combinação de fluorescência e imagem CARS nas imagens apresentadas abaixo.
   4. O CARS e a fluorescência não compartilham PMTs. Use essas configurações para obter o sinal lipídico ideal para obter imagens seletivas da mielinização na área do cérebro. cuidado: Proteger o usuário do feixe de laser
5. Salve as imagens como arquivos .oib, que podem ser importados para um programa de análise de imagem para quantificação adicional (Figura 3).

Resultados

Figura 1: A imagem CARS pode ser combinada com a imagem imunofluorescente. Os gráficos mostram que a imagem CARS ocorre no espectro de sinal vermelho de 660/640 nm. Este comprimento de onda está suficientemente distante da faixa verde, azul ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coloração:
AB Meio:			1n 1.000 mL de Millipore H2O
Fosfato tamponado (PB):
Fosfato de Potássio Monobase	Sigma	P5655
Sodium Phosohate Dibasic		Sigma S7907
BSA (Albumina de soro bovino)	Sigma life science	A2153-100g
Cloreto de Sódio	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE picoemerald laser	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
(420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
(500-530 nm)	Passa-banda Chroma Technology	HQ515/30m-2P
filtros (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Microscópio confocal	Olympus	FV1000
Pipeta de transferência de corte	Fisher	13-711-7M
longpass dicróico 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
longpass dicróico 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
shortpass dicróico 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
prato de cultura com fundo de vidro	MatTek	P35G-0-10-C
peso do vidro (haste boro de 10 mm x 10 mm)	Allen Scientific Glass Inc
680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS

Filtro passa-banda Filtro passa-banda Filtro de emissão de shortpass multifotônico