Imagem da dinâmica do cálcio em células ciliadas da linha lateral de larvas de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Lukasz, D., et al. Imagem de cálcio in vivo de células ciliadas da linha lateral em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra imagens ao vivo do influxo de cálcio nas células ciliadas da linha lateral de uma larva de peixe-zebra transgênica paralisada usando um microscópio confocal. A estimulação mecânica dos feixes de cabelo por meio de pulsos de fluido induz a entrada de cálcio através de canais de mecanotransdução e canais dependentes de voltagem, que é visualizado em tempo real usando indicadores de fluorescência. O método destaca a dinâmica apical e basal do cálcio nas células ciliadas do neuromasto, elucidando seu papel na detecção do movimento da água.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Fixação e imobilização de larvas na câmara de imagem
   1. Banhar uma larva Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) em aproximadamente 1 mL de tampão embrionário (E3) contendo 0,04% de MS-222 por 1–2 min na superfície encapsulante de silicone da câmara de imagem até que a larva fique imóvel ou não responda ao toque.
      1. Sob um estereomicroscópio, posicione a larva no centro da câmara de perfusão de forma que fique plana de lado contra o encapsulante de silicone.
         NOTA: Para consistência, sempre monte as larvas do mesmo lado (por exemplo, lado direito para baixo, lado esquerdo para cima) (Figura 2B1).
   2. Usando uma pinça fina, traga um pino de cabeça de 0,035 mm para baixo perpendicularmente à larva e à câmara. Insira o pino da cabeça entre o olho e a vesícula ótica e para baixo no encapsulante (Figuras 1B1 e 1B2). Use um segundo conjunto de pinças para estabilizar a larva ao longo de seu lado dorsal ou ventral enquanto prende. Certifique-se de que a parte horizontal do pino entre em contato com a larva e não pressione totalmente o encapsulante. Incline o pino ventralmente (Figura 1B1) ou apontando ligeiramente para a parte anterior do peixe para evitar interferir na injeção cardíaca subsequente e na imagem das células ciliadas.
      1. Usando a pinça, insira um pino de cauda de 0,025 mm na notocorda o mais próximo possível da extremidade da cauda (Figura 1B1).
         NOTA: Tenha cuidado para evitar esticar a larva. Prenda a larva plana. Os olhos devem ser sobrepostos (Figura 2B1). Isso é muito importante para facilitar a injeção cardíaca (Figura 1B2-B2', etapa 3), facilitar um plano de imagem desejável (Figura 1B1-B2'', etapas 5) e quantificar a intensidade do estímulo do jato de fluido (Figura 3A3, etapa 4).
2. Injeção de α-bungarotoxina na cavidade cardíaca para paralisar a larva

NOTA: Use luvas ao manusear α-bungarotoxina.

1. Centrifugue a alíquota de α-bungarotoxina brevemente antes de usar para evitar o entupimento da agulha de injeção cardíaca.
   1. Preencha 3 μL de solução de α-bungarotoxina em uma agulha de injeção cardíaca usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel. Carregue a solução uniformemente até a ponta, sem bolhas.
   2. Insira a agulha de injeção cardíaca em um porta-pipetas conectado a um micromanipulador manual. Sob um estereomicroscópio, posicione a agulha de forma que fique alinhada perpendicularmente ao eixo AP das larvas fixadas e anestesiadas, apontando para baixo em um ângulo de ~ 30 °.
   3. Conecte o porta-pipeta ao injetor de pressão. Aplique as seguintes configurações sugeridas: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0.5 s e Pcompensation = 5 hPa. Injete um bolus na solução para testar se a ponta da agulha está patente.
   4. Procure uma pequena baforada da solução vermelha (de vermelho de fenol) para deixar a ponta da agulha. Se nenhuma cor vermelha for vista, raspe suavemente a ponta da agulha contra a borda de um alfinete e tente novamente até que a agulha esteja patente. Como alternativa, puxe uma agulha com uma abertura de ponta maior.
2. Avance a agulha em direção ao coração até que ela toque a pele fora do coração (Figura 1B2). Pressione a agulha na larva e procure o recuo da célula pigmentar na pele na frente do coração para garantir que a agulha esteja posicionada no plano correto em relação à larva (Figura 1B2 ').
   1. Avance ainda mais a agulha até que ela perfure a pele e entre na cavidade cardíaca. Puxe a agulha ligeiramente para trás. Injete um bolo de α-bungarotoxina na cavidade cardíaca. Procure a inflação da cavidade cardíaca ou o corante vermelho entrando na cavidade.
3. Enxágue suavemente a larva 3 vezes com 1 mL de tampão neuronal (NB) para remover o MS-222 residual. Nunca remova todo o fluido. Mantenha a larva em aproximadamente 1 mL de RN na câmara de perfusão.
   NOTA: Certifique-se de que os batimentos cardíacos e o fluxo sanguíneo das larvas permaneçam robustos após a fixação e injeção cardíaca e durante todo o experimento de imagem.
4. Preparação da configuração do microscópio e do jato de fluido
   1. Monte um microscópio confocal vertical usando os componentes descritos na Tabela de Materiais: um microscópio confocal com um laser de 488 nm e filtros apropriados, software de microscópio para controlar e coordenar imagens e estimulação, objetiva de ar 10x, objetiva de água 60x, scanner de objetiva piezo-Z (para pilhas z), câmera de alta velocidade, câmara circular adaptador, platina motorizada e adaptador de inserção de platina.
   2. Monte o jato de fluido composto por 3 componentes principais: uma bomba de vácuo e pressão, pinça de pressão de alta velocidade e estágio de cabeça (também descrito na Tabela de Materiais). Use a pinça de pressão de alta velocidade para controlar o tempo e a duração da pressão ou descarga de vácuo para fora do estágio de cabeçote e para a pipeta de jato de fluido.
      1. Conecte a saída do estágio da cabeça ao suporte da pipeta de jato de fluido por meio de um tubo de silicone de paredes espessas.
5. Alinhamento de larva e jato de fluido

NOTA: Existem 3 planos de interesse dentro de cada neuromast: (1) as pontas dos feixes de cabelo (Figura 3A3: os cinocílios, usados para medir a intensidade do estímulo); (2) o plano de mecanotransdução do feixe de cabelo (MET) (Figura 2B1-B1': a base dos feixes capilares apicais onde os sinais de cálcio dependentes do canal MET são detectados); e (3) o plano sináptico (Figura 2B2-B2': onde os sinais pré-sinápticos de cálcio são detectados na base da célula ciliada). Esses planos são descritos na Figura 2A.

1. Preencha 10 μL de NB em uma agulha de jato de fluido devidamente quebrada usando uma ponta de carregamento de gel. Carregue a solução uniformemente até a ponta, sem bolhas. Insira a agulha no porta-pipetas conectado ao micromanipulador motorizado.
2. Coloque a câmara de perfusão em um adaptador de câmara circular no microscópio stage. nota: Para consistência, sempre posicione a larva na mesma orientação (por exemplo, a câmara que contém a larva com a parte posterior voltada para o jato de fluido e o lado ventral voltado para o experimentador).
   1. Mova o estágio motorizado para que a larva fique no centro do campo de visão. Gire o adaptador de câmara circular de modo que o eixo ântero-posterior (AP) da larva fique aproximadamente alinhado com a trajetória da agulha de jato de fluido.
   2. Usando luz transmitida e contraste de interferência diferencial (DIC), coloque a larva em foco e centralize-a sob a objetiva de 10x. Aumente o objetivo de 10x.
3. Usando o micromanipulador motorizado, abaixe a agulha do jato de fluido para o centro do campo de visão para que seja iluminada pela luz transmitida e mal tocando a solução NB.
   1. Diminua o objetivo de 10x. Concentre-se na larva para confirmar sua localização. Concentre-se para encontrar a agulha do jato de fluido. Mova a agulha de jato de fluido com o micromanipulador nos eixos x e y até que esteja em uma posição paralela ao lado dorsal do peixe.
   2. Concentre-se novamente na larva. Traga a agulha para baixo no eixo z. Posicione a agulha ao longo do lado dorsal do peixe e ~ 1 mm de distância do corpo (Figura 3A1).
   3. Mova cuidadosamente o adaptador da câmara circular (se necessário) para garantir que a agulha do jato de fluido esteja alinhada ao longo da linha média AP da larva ( Figura 3A1 ).
   4. Mova o estágio motorizado para colocar o neuromastro de interesse no centro do campo de visão. Mantenha a ponta da agulha do jato de fluido ao longo do lado dorsal do peixe. Não toque a ponta da agulha do jato de fluido na larva ou na superfície da câmara.
4. Mude para a objetiva de água 60x. Certifique-se de que a objetiva esteja imersa na solução NB. Use o foco fino para localizar um neuromast usando luz transmitida e óptica DIC.
   NOTA: Esta configuração foi projetada para estimular os neuromastos ao longo da linha lateral posterior primária. As células ciliadas dentro desses neuromastos respondem ao fluxo de fluido direcionado anterior ou posterior.
   1. Posicione a agulha de jato de fluido com o micromanipulador de modo que fique a 100 μm da borda externa do neuromast (Figura 3A2).
      NOTA: Escolha neuromastos que ofereçam vistas claras de cima para baixo (Figuras 2B1'-B2' e Figura 3A3) em vez de vistas laterais (Figura 2C1-C2). Uma visão clara de cima para baixo permite imagens simultâneas de todos os feixes de pêlos apicais em um único plano óptico ou imagens de áreas sinápticas em menos planos ópticos (Figura 3A3).
   2. Concentre-se até as pontas dos feixes de pêlos apicais (cinocílios) (Figura 1A, Figuras 3A2 e 3A3). A parte inferior da agulha do jato de fluido deve estar em foco neste plano.
5. Defina o grampo de pressão de alta velocidade do modo manual para o modo externo para receber entrada do software de imagem.
   1. Zere o grampo de pressão de alta velocidade pressionando o botão "zero". Use o botão de ponto de ajuste para definir a pressão de repouso ligeiramente positiva (~2 mmHg). Confirme a saída de repouso do clamp de pressão de alta velocidade usando um manômetro de libras por polegada quadrada (PSI) conectado à saída do estágio principal.
      NOTA: Defina uma pressão ligeiramente positiva em repouso para evitar a absorção gradual de fluido na agulha do jato de fluido ao longo do tempo. Se o fluido entrar na tubulação conectada ao jato de fluido e atingir o estágio principal, ele pode danificar o equipamento.
   2. Determine a pressão necessária para estimular os feixes de cabelo. Use uma entrada de 0.125 e 0.25 V (6.25 e 12.5 mmHg) por 200–500 ms para aplicar um estímulo de teste (Figura 3A3-A3'').
      NOTA: A pinça de pressão de alta velocidade converte uma entrada de tensão (de software ou outros dispositivos que se conectam à porta de comando de baioneta Neill-Concelman (BNC) na porta de comando da pinça de pressão de alta velocidade) em pressão que é descarregada do estágio principal, e, finalmente, a agulha de jato de fluido (1,0 V = 50 mmHg, enquanto -1,0 V = -50 mmHg). Nesta configuração (consulte a etapa 4.2), a pressão positiva (empurrão) desvia os feixes de cabelo para a parte anterior e a pressão negativa (puxão) desvia os feixes de cabelo para a parte posterior.
   3. Usando luz transmitida e óptica DIC juntamente com uma barra de escala, meça a distância de deflexão pelos estímulos de 6,25 e 12,5 mmHg das pontas dos feixes de cabelo, os cinocílios (Figura 2A e Figuras 3A3-3''). Escolha uma pressão que mova os feixes (como 1 unidade coesiva) a uma distância de aproximadamente 5 μm (Figura 3A3''). Certifique-se de que as pontas dos cinocílios permaneçam em foco o tempo todo.
   4. Mova o jato de fluido ± 25 μm ao longo do eixo AP da larva para encontrar uma distância e pressão que desvie as pontas dos cinocílios 5 μm.
      NOTA: Usando GCaMP6s em larvas 3–7 dias após a fertilização (dpf), uma deflexão de 5 μm deve atingir sinais de cálcio GCaMP6s próximos à saturação e não deve danificar as estruturas apicais do feixe de cabelo (Figura 3A3 ''). Distâncias de deslocamento menores podem ser usadas para fornecer estímulos não saturantes (Figura 3A3 '). Distâncias de deslocamento >10 μm são difíceis de estimar (Figura 3A3''') e podem ser prejudiciais ao longo do tempo. A saturação do sinal depende da idade do neuromast (e da altura cinocilial), bem como do indicador usado. Verifique a permeabilidade da agulha do jato de fluido em cada direção (pressão/empurrar e vácuo/puxar) periodicamente durante a imagem. As agulhas de jato de fluido entopem facilmente e perdem a permeabilidade do vácuo, mas mantêm a permeabilidade da pressão residual. Use a óptica DIC e um estímulo de teste curto em cada direção para verificar a permeabilidade do jato de fluido.
   5. Concentre a amostra no plano de interesse (por exemplo, a base dos feixes capilares apicais ou a base da célula ciliada no plano sináptico; Figura 2B1-B2').
6. Procedimento de aquisição de imagem: Aquisição de plano único

NOTA: Todas as imagens descritas neste protocolo são realizadas à temperatura ambiente (RT).

1. Configure o software de imagem para adquirir um streaming ou aquisição contínua de 80 quadros com uma captura a cada 100 ms para atingir uma taxa de quadros de 10 Hz.
2. Defina o ganho, a abertura e a potência do laser para otimizar a detecção do sinal, mas evite saturação, fotobranqueamento e ruído. Example configurações para um Opterra/SFC são as seguintes: Potência do laser de 488 nm: 50 (plano MET do feixe de cabelo), 75 (plano sináptico); Fenda de 35 μm; ganho = 2,7; Ganho EM = 3900.
   NOTA: Aplique 2 X binning se os sinais forem muito fracos ou ruidosos ou tiverem fotobranqueamento excessivo. O binning 2 X melhorará a detecção de sinal ao custo da resolução espacial.
3. Selecione um estímulo a ser entregue durante a aquisição de 80 quadros (8 s) após o quadro 30, a 3 s.
   NOTA: Alguns exemplos de estímulos são os seguintes: 200 ms (+ ou - 0,25 V) até 2 s (+ ou - 0,25 V) passo na direção anterior ou posterior para identificar a sensibilidade direcional de cada célula ciliada; 2 s, Onda quadrada de 5 Hz (0,25 V por 200 ms, -0,25 V por 200 ms, repetida 5 vezes) para estimular todas as células ciliadas simultaneamente. Uma pressão positiva (estímulo anterior) ativará metade das células ciliadas. Uma pressão negativa (estímulo posterior) ativará a outra metade das células ciliadas. Certifique-se de que o software ou dispositivo de estímulo retorne a pressão clamp de volta para 0 V após o término do estímulo.
4. Meça as respostas de cálcio mecanosensíveis. Concentre-se na base dos feixes de pêlos apicais (Figuras 2A e 2B1-B1') e inicie a aquisição da imagem.
   NOTA: Se o neuromastro for visto claramente de cima para baixo (Figura 2B1-B1'), todos os feixes de pêlos apicais podem ser visualizados simultaneamente em um único plano.
5. Meça as respostas pré-sinápticas de cálcio. Concentre-se na base das células ciliadas (Figuras 2A e 2B2-B2') e inicie a aquisição da imagem.
   NOTA: Se o neuromast for visto claramente de cima para baixo (Figura 2B2-B2'), os planos de imagem pré-sinápticos de todas as células ciliadas podem ser adquiridos em 2–3 planos separados por 2 μm. Peixes transgênicos Tg [myo6b: ribeye-mcherry] podem ser usados para identificar e localizar fitas pré-sinápticas e locais de entrada de cálcio.

Resultados

Figura 1: Câmara de imagem, montagem de peixe-zebra e procedimentos de injeção cardíaca e agulhas. (A) É mostrada uma câmara de imagem com uma larva (delineada por um retângulo tracejado) presa ao centro no topo do encapsulante de silicone. <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Para paralisar larvas antes da aquisição de imagens
Câmara de imagem	Siskiyou	PC-R	Plataforma para montar larvas para aquisição de imagens
N.º 1.5 Lamínulas quadradas, 22*22 mm	VWR	48366-227	Para selar a câmara de imagem
Graxa de silicone de alto vácuo	Fischer Scientific	14-635-5D	Para fixação de lamínula na câmara de imagem
Encapsulante de silicone transparente 0,5 g kit	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5KG	Para preencher a câmara de imagem para criar uma superfície para fixar peixes
Estereomicroscópio	Carl Zeiss Microscopia	Stemi 2000 com iluminação de luz transmitida	Para iluminar fios, pinças e tesouras para fazer alfinetes
Pinças finas	Ferramentas de Ciências Finas	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Item nº 11295-10	Para fazer alfinetes
Tesouras finas	Cole-Palmer	5,5", EW-10818-00	Para cortar fio tunsgten para fazer alfinetes
Fio de tungstênio, 0,035 mm	Goodfellow	W005131	Para alfinetes de cabeça para imobilizar larvas
Fio de tungstênio, 0,025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Para pinos de cauda para imobilizar larvas Capilares
de vidro borossilicato sem filamento	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Vidro a ser puxado para dentro de agulhas de jato de fluido para estimular células ciliadas
Pinça fina	Ferramentas de ciências finas	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Item nº 11295-10	Para fixar larvas
Gel dicas de carregamento	Eppendorf	5242956003	Para enchimento de agulhas de injecção cardíaca
Estereomicroscópio	Carl Zeiss Microscopia Stemi	2000 com iluminação de luz transmitida	Para iluminar larvas durante a fixação e injecção cardíaca
Capilar/porta-agulhas de vidro	WPI	MPH315	Para segurar agulhas de jacto de fluido
Micromanipulador manual	Narishige	M-152	Para segurar e posicionar o porta-agulha para injetar α-bungarotoxina
Suporte magnético	Narishige	GJ-1	Para segurar o micromanipulador manual para injeção de α-bungarotoxina
Injetor de pressão	Eppendorf	Femtojet 4x	Para fornecer α-bungarotoxina
Microscópio confocal	Bruker	Swept field/Opterra confocal	Microscópio fixo e vertical com óptica DIC e laser de 488nm com filtros apropriados
Software de microscópio	Bruker	Prairieview 5.3	Para coordenar e controlar o microscópio, lasers, palco, piezo-z, câmeras e jato de fluido
Objetiva de ar de 10x	Nikon	MRH00101	Baixa ampliação para posicionamento de larvas e jato de fluido
Objetiva de água de 60x	Nikon	MRF07620	Objetiva de imersão em água com alta NA (1,0) e distância de trabalho adequada (2,0 mm)
Scanner de objetiva Piezo-Z com controlador/driver	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Aquisição de pilha z de alta velocidade com precisão de 0,025um
Câmera EMCCD	QImaging	Rolera EM-C2 Câmera EMCCD	Câmera com tamanho de pixel pequeno que pode adquirir até 100 quadros por s
Adaptador	de câmara circularSiskiyou	PC-A	Para segurar e girar a câmara de imagem na platina do microscópio
Platina motorizada Z-deck	Prévia Científica	ZDN12MP	Platina do microscópio que pode segurar e mover amostras e micromanipuladores com agulha de jato de fluido juntas
Adaptador de inserção de platina Z-deck	NIH Oficina	de máquinas personalizada	Para encaixar o adaptador de câmara circular na platina z-deck
Aparelho	de jato de fluidoALA scientific instruments	HSPC-1 Braçadeira de pressão de alta velocidade com PV-PUMP	Para controlar e fornecer o estímulo de jato de fluido
Tubo de silicone curado com peróxido Masterflex (1 ft)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Para conectar o porta-agulha de jato de fluido à bomba de pressão
Micromanipulador motorizado	Sutter Instrument Company	MP-225	Para segurar e posicionar o porta-agulha para fluido
controlador de micromanipulador	Sutter Instrument Company	MPC-200	Para controlar o manipulador de agulhas de jato de fluido
Pontas de carregamento de gel	Eppendorf	5242956003	Para aterro de agulhas de jato de fluido
Capilar de vidro/porta-agulhas	WPI	MPH315	Para segurar agulhas de jato de fluido
Manômetro PSI	Sper Scientific	840081	Para medição saída de pinça de pressão
Prism7	Graphpad	Prism7	Software para traçar mudanças
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/	Software para processar imagens e criar mapas de sinais espaço-temporais
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin para registrar sequências de imagens GCaMP6 no FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin para registrar sequências de imagens GCaMP6 no FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Departamento de Neurobiologia, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin para criar vários ROIs para medir as mudanças de intensidade do GCaMP6

de jato de intensidade GCaMP6<