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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação
1. Provoque cada músculo em pequenos feixes de fibras de cerca de 1 mm de largura usando duas pinças serrilhadas finas.
NOTA: É crucial manipular os músculos muito suavemente com a pinça, sem força excessiva, para evitar danos aos tecidos durante a provocação.
1. Dissocie o músculo tibial anterior (TA) em 3 ou 4 feixes, dependendo do seu tamanho.
2. Para gastrocnêmio (GA), separe as partes medial e lateral do músculo e, em seguida, dissocie cada parte em 4-5 feixes, dependendo de seu tamanho.
2. Imunocoloração
1. Prossiga com a permeabilização das fibras musculares: Transfira os feixes musculares para placas de 24 poços contendo 1% (v / v) de Triton X-100 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e mantenha-os sob agitação suave (50 rpm) por 1 h em RT ou 5 h a 4 ° C.
NOTA: Divida os feixes musculares entre duas placas para prosseguir com imunocolorações separadas e minimizar o risco de confusão de anticorpos. Não os divida em mais de dois poços (1 poço/placa); caso contrário, o número (N) de junções neuromusculares (NMJs) que são representativas de seu estado geral no músculo analisado pode ser insuficiente.
2. Lave as amostras 3x por 5 min com PBS em RT e incube-as com uma solução de bloqueio composta de albumina de soro bovino (BSA) a 4% em PBS/Triton X-100 1% por 4 h a 4 °C, sob agitação suave (50 rpm).
NOTA: Não use uma bomba de aspiração durante as etapas de lavagem, mas aspire a solução manualmente com uma pipeta de 200 μL e pontas pequenas (a referência é indicada na Tabela de Materiais).
3. Incubar as amostras durante a noite (O/N) a 4 °C sob agitação suave (50 rpm) com a solução de bloqueio indicada na etapa 2.2 contendo anticorpos monoclonais primários contra o neurofilamento M (NF-M, 2H3, diluição 1/200) ou glicoproteína de vesícula sináptica 2 (SV2, diluição 1/200) para marcar terminais de axônios pré-sinápticos ou zonas ativas, respectivamente.
4. No dia seguinte, lave os feixes musculares 3x por 5 min em PBS sob agitação (50 rpm).
1. Para imagens confocais: Incubar os feixes musculares com anticorpos anti-camundongo secundários conjugados com um fluoróforo emissor de vermelho (F594) (diluição 1/500) e α-bungarotoxina conjugada com um fluoróforo emissor de verde (α-BTX-F488) (diluição 1/1000) em PBS por 2 h em RT sob agitação (50 rpm).
2. Para imagens de depleção por emissão estimulada (STED): Incubar os feixes musculares com anticorpos anti-camundongo secundários conjugados com um fluoróforo emissor verde (F488) (diluição 1/500) e α-bungarotoxina conjugada com um fluoróforo emissor de vermelho distante caracterizado por alta fotoestabilidade (α-BTX-F633) (diluição 1/1000) em PBS por 2 h em RT sob agitação (50 rpm).
NOTA: Não exponha as amostras à luz durante a incubação para evitar o fotobranqueamento.
5. Lave os feixes musculares rotulados 3x por 5 min com PBS sob agitação (50 rpm) e coloque-os em uma lâmina com um meio de montagem.
NOTA: Coloque no máximo 4 a 5 feixes musculares por lâmina para permitir a vedação.
6. Adicione uma lamínula de vidro grau #1.5 (ou #1.5H) (0.17 mm de espessura) na parte superior e coloque ímãs cilíndricos em ambos os lados da lâmina para aplicar pressão e achatar os músculos.
7. Mantenha os slides protegidos da luz O/N a 4°C. Sele os slides permanentemente com esmalte.
3. Aquisição de imagem
1. Aquisições por um microscópio confocal
NOTA: As imagens foram coletadas com um microscópio confocal de varredura a laser invertido usando uma objetiva de imersão em óleo de magnitude 63x (HCX Plan Apo CS, abertura numérica de 1,4 (NA)).
1. Para análise cega, deixe uma pessoa não envolvida na análise codificar cada slide com um determinado número. Permanecer cego para os grupos experimentais até que a quantificação dos parâmetros NMJ esteja completa para todas as amostras.
2. Inicie o software do microscópio no modo de configuração > >machine.xlhw.
3. Coloque a lâmina no microscópio stage e encontre o plano de observação dentro da amostra olhando sob a iluminação de fluorescência de campo amplo DAPI com o conjunto de filtros DAPI.
4.Clique em Abrir Projeto > Novos Projetos> e crie uma pasta para armazenar as aquisições de imagens.
NOTA: Crie um novo projeto para cada NMJ para limitar o tamanho da pasta e evitar problemas de memória do computador.
5. Para gerenciar os parâmetros de aquisição, clique na janela da guia Aquisição e defina o orifício confocal para 1.0 Unidade Airy e potência do laser para otimizar os níveis de ganho e deslocamento para a fluorescência verde/F488 (α-BTX) usando um laser de 488 nm na placa terminal que deve ser fotografada (modo Live ON).
6. Em seguida, otimize a aquisição de fluorescência vermelho/F594 (NF-M ou SV2) usando um laser adaptado à observação F594. Neste estudo, foi utilizado um laser de 552 nm (modo Live ON). Defina o espectro de emissão de corante com as seguintes faixas para cada laser: laser 405 (DAPI) de 414 a 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) de 506-531 nm e laser 552 (NFM/SV2) de 622-650 nm.
7. Colete pilhas de imagens de junções neuromusculares em cada grupo experimental com as mesmas configurações: tamanho da imagem 1024 x 1024 pixels (73,7 x 73,7 μm) a 400 Hz taxa de amostragem, Bidirecional X LIGADO, fator de zoom 2,5, tamanho Z-step 0,5 μm no modo Z-Wide.
NOTA: Para cada NMJ, o número de fatias é definido para adquirir toda a junção. As configurações de aquisição descritas acima atendem ao teorema de amostragem de Nyquist-Shanon. No entanto, o usuário pode clicar no botão Otimizar formato, presente em todos os softwares operacionais confocais recentes, para garantir que o tamanho do pixel e o Z-step atendam à taxa de amostragem ideal de Nyquist. Essa ação evitará imagens com amostragem excessiva ou insuficiente, o que causará perda de precisão nas medições de volume.
8. Salve o arquivo original (.lif) ou as imagens da pilha Z (.tif) em uma pasta com um nome que inclua o nome do código da lâmina, o tipo de coloração e o número da placa final.
NOTA: Colete sequencialmente (não simultaneamente) as varreduras usando os lasers de 488 nm e 552 nm (F488 e F594) para evitar diafonia da fluorescência F488 no canal F594 e vice-versa (sangramento). O caminho do feixe pode ser configurado com o Dye Assistant no software do microscópio.
9. Mude para o próximo slide codificado e repita as etapas 3.1.3-3.1.8 para cada NMJ.
10. Ao final da sessão, clique em Abrir no Visualizador 3D e escolha um representante NMJ de um grupo experimental para visualizar a rotulagem 3D.
NOTA: Este modo de visualização ajudará a verificar se os parâmetros de aquisição estavam corretos.
11. Feche o software do microscópio, limpe as objetivas com lenços de papel e desligue o sistema.
2. Aquisições por microscopia STED
NOTA: As imagens foram coletadas com um microscópio confocal de varredura a laser invertido equipado com Gated STED a 775 nm usando uma objetiva de imersão em óleo de 100x (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. Para análise cega, deixe uma pessoa não envolvida na análise codificar cada slide com um determinado número. Permanecer cego para os grupos experimentais até que a quantificação dos parâmetros NMJ esteja completa para todas as amostras.
2. Inicie o software do microscópio no modo de configuração > machine.xlhw e STED ON.
3. Clique em Abrir projeto > Novos projetos para criar uma pasta para armazenar aquisições de imagens.
>OBSERVAÇÃO: Gere uma nova pasta para cada slide para limitar o tamanho da pasta e evitar problemas de memória do computador.
4. Coloque a lâmina no microscópio stage e visualize-a sob iluminação de fluorescência de campo amplo usando o laser de 488 nm para encontrar o plano de observação dentro da amostra.
5. Procure por um NMJ marcado com coloração de neurofilamento M (NFM) ou SV2 usando o laser de 488 nm com uma detecção espectral de 506-531 nm.
6. Quando um NMJ for identificado, clique em Ativar STED e comece a adquirir imagens em uma região que contenha várias dobras juncionais usando o laser de 635 nm com uma detecção espectral de 640-750 nm.
>NOTA: Tenha cuidado com a tabela de pesquisa de saturação durante a aquisição da imagem e clique no botão Quick LUT para evitar superexposição (valores de cinza >255; para 8 bits).
7. Colete as imagens de cada grupo experimental com as mesmas configurações: tamanho da imagem 2048 x 2048 pixels (38,75 x 38,75 μm) a uma taxa de amostragem de 400 Hz.
NOTA: A potência do laser de depleção (STED) está definida para 65%.
8. Salve as imagens com um nome de arquivo que inclua o código do slide.
NOTA: É possível clicar em Optimized XY Format: Set Format para obter a melhor configuração de aquisição com imagens STED.
9. Mude para o próximo slide codificado e repita as etapas 3.2.3-3.2.8. Repita este procedimento para todos os slides.
10. No final da sessão de microscopia STED, transfira os arquivos de imagem para outro computador e salve os arquivos originais (.lif) em uma unidade ou servidor externo.
11. Desligue o software do microscópio, limpe as objetivas com lenços de papel da lente e desligue o sistema.