Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Resumo

Um método simples e rápido para determinar o potencial de sacarificação de um grande número de amostras de biomassa vegetal é descrito. A plataforma automatizada para esta análise envolve a preparação da biomassa de plantas para análise em 96 placas bem e do desempenho posterior de hidrólise pré-tratamento e quantificação dos açúcares liberados.

Resumo

Polissacarídeos que compõem a biomassa vegetal lignocelulósica pode ser dividido para produzir uma variedade de açúcares que posteriormente podem ser utilizados no estabelecimento de uma biorefinaria. Essas matérias-primas que constituem uma nova plataforma industrial, que seja sustentável e carbono neutro, para substituir a actual dependência de combustíveis fósseis. A recalcitrância à desconstrução observado em materiais lignocelulósicos é produzido por várias propriedades intrínsecas das paredes celulares das plantas. Celulose cristalina é incorporado na matriz de polissacarídeos, tais como xilanas e arabinoxilanos, e toda a estrutura é envolto pela fenólicos polímero da lignina, que também é difícil de digerir ^1. A fim de melhorar a digestibilidade dos materiais vegetais precisamos descobrir os principais gargalos para a sacarificação das paredes das células e também mutante tela e populações reprodutoras para avaliar a variabilidade na sacarificação ^2. Estas tarefas requerem uma abordagem de alto rendimento e aqui apresentamos uma plataforma analítica que pode realizar a análise sacarificação em um formato placa de 96 poços. Esta plataforma foi desenvolvida para permitir o rastreamento de digestibilidade da lignocelulose de grandes populações de espécies de plantas variadas. Nós temos reduzido os volumes de reação para pré-tratamento gentil, hidrólise enzimática parcial de açúcar e determinação, para permitir que um grande número de ser avaliado rapidamente em um sistema automatizado.

Esta plataforma automatizada trabalha com quantidades de miligramas de biomassa, realizando moagem, sob condições controladas para reduzir os materiais vegetais a uma granulometria padronizada de forma reproduzível. Depois que as amostras são moídas, o robô automatizado dispensa a formatação quantidades especificadas e registradas de material nos poços correspondentes da placa de 96 poços profundos (Figura 1). Normalmente, nós dispensar o mesmo material em 4 poços de ter 4 repetições para análise. Uma vez que as placas são preenchidos com o material vegetal no layout desejado, eles são movidos manualmente para uma estação de manipulação de líquidos (Figura 2). Nesta estação as amostras são submetidas a um pré-tratamento leve com um ácido diluído ou alcalina e incubadas a temperaturas de até 90 ° C. A solução de pré-tratamento é posteriormente removida e as amostras são lavadas com tampão para devolvê-los a um pH adequado para a hidrólise. As amostras são então incubados com uma mistura de enzimas por um período de tempo variável, a 50 ° C. Uma alíquota é retirada do hidrolisado e os açúcares redutores são automaticamente determinados pelo método colorimétrico MBTH.

Protocolo

1. Preparação das amostras

Nós normalmente trabalham com hastes de qualquer herbáceas ou plantas lenhosas. No caso de materiais de herbáceas que crescem as plantas até o vencimento, e após o desenvolvimento da semente que coletamos hastes seco uma vez a senescência está completa. As hastes são cortadas em quatro segmentos mm e colocadas em 2 frascos ml com três bolas de moagem. No caso de materiais lenhosos, as amostras são moídas para serragem grossa de madeira com um arquivo do curso e, em seguida, colocada em um moinho de bolas para processamento posterior.

As amostras são colocadas em um rack dentro da moagem / formatação estação (Figura 1). Esta estação seqüencialmente grinds, mixagens, e pesa cada amostra. O número de repetições necessárias por amostra é estabelecida pelo teste do material moído em uma série de experimentos preliminares em que a variabilidade intrínseca para um tamanho de partícula certo é determinada. Os 2 mL são perfurados na parte inferior e os materiais são dispensados ​​pela vibração do frasco sobre o bem selecionado. O braço oscilante é controlado por um feedback de equilíbrio que permite a distribuição exata do pó. O robô dispensa 4 mg / poço em uma análise standard e 4 repetições são necessários na maioria dos casos. Isto permite que 20 amostras de plantas / placa a ser analisado.

2. Pré-tratamento

Depois que as amostras são formatados, as placas de 96 poços são processadas por um sistema automatizado líquido de manejo (Figura 2). Aqui, um pré-tratamento é realizado em leve os materiais vegetais, adicionando 350 mL de ácido ou soluções alcalinas e aquecimento da placa em um bloco adaptado. Para evitar evaporação durante a análise, os 96 pratos são bem selado com um mate silicone. A temperatura eo tempo de pré-tratamento pode ser modificado de acordo com os materiais em estudo. A temperatura máxima, no entanto, é de 100 ° C. Um procedimento alternativo para o teste pré-tratamentos mais duras é para pré-tratamento dos materiais fora de linha e eliminar o pretreatmet do processo.

3. Hidrólise

1. Após os materiais são pré-tratados, o robô automaticamente remove a solução de pré-tratamento e lavagens, todos os poços, 5 vezes com 850 mL tampão acetato 25 mM. Os enxaguatórios são realizadas pela adição de tampão à solução de pré-tratamento e, posteriormente, removendo 50% do volume total depois de permitir que os sólidos na amostra para resolver. A altura da aspiração é fixado em metade da massa de líquido para evitar a aspiração de sólidos do fundo do poço, não há perda desprezível de sólidos usando essa abordagem. Após estas lavagens do pH no poço é de 4,5 eo material está pronto para a hidrólise enzimática.
2. Uma mistura de enzimas contendo uma solução de celulases e hemicelulases é adicionado pelo robô. Em cada poço, 850 mL da mistura de enzimas é dispensada ea placa é transferida para uma 50 ° C agitando incubadora. A hidrólise padrão é realizada por 8 h, mas desta vez pode ser adaptado para a finalidade do experimento. O carregamento da enzima padrão usado para gramíneas é de 7 FPU / g de material.

4. Detecção de açúcares redutores

Determinação de açúcares redutores liberados após a hidrólise foi realizada utilizando uma versão modificada do 3-metil-2-benzothiazolinone zona hídrica método (MTBH) ^3. MBTH foi selecionado como o método mais adequado, porque era mais fácil de automatizar e menos suscetível a interferência de tais compostos como proteínas. Nós modificamos este método altamente sensível para uso na plataforma robótica para que pudesse quantificar com precisão os açúcares nas concentrações presentes no hidrolisado de biomassa, com um volume final de 250 mL que é adequado para um padrão de 96 placa óptica bem. Todos os passos a seguir são executadas automaticamente e três determinações independentes dos açúcares redutores foram realizadas para cada reação sacarificação.

1. 30 mL de hidrolisado foi retirado da placa de poço profundo e misturado com 45 mL de tampão acetato 25 mM de sódio em um contornou PCR placa de 96 poços.
2. 25 mL de NaOH 1N e 50 ul de uma solução contendo 0,43 mg / ml MBTH e 0,14 mg / ml DTT foram adicionados.
3. Após a mistura, a placa de PCR foi aquecida a 60 ° C por 20 min em um termociclador ou dispositivo similar que oferece exatamente a mesma quantidade de calor para todos os 96 poços.
4. A reação resultante foi transferido para uma placa óptica.
5. Adicionar 100 ul do reagente oxidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% de ácido sulfâmico e 0,1% HCl). Misture bem e deixe a desenvolver por pelo menos 1 h.
6. Cada chapa deve conter também as reações padrão de 50 nmol, 100 e 150 nmol de glicose nmol. As placas ópticas são lidas a 620 nm.

5. Resultados representativos:

Exemplos de diferentes tipos de análises são apresentados na figura 3 e 4. Todos os resultados foram obtidos utilizando a plataforma automatizada. Figura 3 reapresenta o aumento de açúcares redutores liberados por 8 h de incubação poplar terreno com quantidades crescentes de enzimas celulolíticas. A Figura 4 apresenta os efeitos do ácido e pré-tratamento alcalino em amostras de álamo. O pré-tratamento NaOH é mais eficiente que o pré-tratamento H2SO4 diluído em facilitar a liberação de açúcares durante a hidrólise. A quantidade de açúcares medidos após hidrólise diminui quando o pré-tratamento é realizado com concentrações superiores a NaOH 1M.

Figura 1. Estação Robotic para moer e 96 de formatação bem de biomassa

Figura 2. Estação de tratamento de líquido para a análise de Alto Rendimento sacarificação

Figura 3. Efeito de cargas enzima diferente sobre a libertação de equivalentes redutores de açúcar a partir de amostras de álamo

Figura 4. Açúcares Efeito de diferentes pré-tratamentos na sacarificação de amostras de álamo. A. liberado após pretreament com diferentes porcentagens de H2SO4 a 90 ° C por 30 minutos. Açúcares B. liberado após pré-tratamentos NaOH à mesma temperatura e tempo do que o pré-tratamento ácido .

Discussão

Variações do protocolo de sacarificação padrão podem ser usadas na mesma plataforma para determinar a atividade das enzimas celulolíticas (ou seja, pela variação das concentrações de enzimas usadas em uma placa, bem como usando papel como substrato); comparação da eficiência de várias misturas enzimáticas em um material específico; curso de tempo para sacarificação; etc.

Um protocolo de sacarificação padrão para comparar o potencial de sacarificação em diferentes materiais vegetais envolve uma hidrólise de oito horas (Figuras 3 e 4). A maioria dos materiais vegetais analisados requer quatro repetições. Nessas condições, a plataforma pode processar 80 amostras/dia. Essa análise está sendo usada para rastrear grandes populações de cevada, milho e braquipódio, a fim de estabelecer a variabilidade no potencial de sacarificação e nos genes envolvidos em sua determinação⁴.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Moagem e pesagem robô	Labman Automação
2 ml micro tubo com tampas	Sarstedt Ltd	72,694
5 milímetros de aço inoxidável contas	Qiagen Ltd	69989
1,2 ml Abgene quadrados bem pratos de armazenamento	Fisher Scientific Ltd	TUL-050-050C
Whatman tampa esteira por 96 quadrados placas bem	Fisher Scientific Ltd	7704-0104
Robot hanling líquido	Tecan Group Ltd.	Liberdade Evo 200
O ácido sulfúrico	Fisher Scientific Ltd	S/9231/PB17
Hidróxido de sódio	Fisher Scientific Ltd	BPE359-500
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S8750-500G
Ácido acético	Fisher Scientific Ltd	A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1.5L	Novozyme	CCN03122
96 bem cheia placas PCR saia	Sarstedt Ltd	72.1980.202
D-Glicose	Fisher Scientific Ltd	G/0450/53
3-Metil-2-hidrato de cloridrato de hidrazona benzothiazolinone	Sigma-Aldrich	129739-25G
DL-ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D9163-1G
Corning microplaca com 96 fundo bem plana	Fisher Scientific Ltd	TKT-521-050H
De amônio sulfato de ferro dodeca (III)	Sigma-Aldrich	F1668-250G
O ácido sulfâmico	Sigma-Aldrich	242772-500G
Ácido clorídrico	Fisher Scientific Ltd	12462-0026