Imagens in vivo do transporte de líquido cefalorraquidiano em um cérebro de camundongo usando macroscopia de fluorescência

Resumo

Fonte: Sweeney, A. M., et al. Imagem in vivo do transporte de líquido cefalorraquidiano através do crânio intacto do camundongo usando macroscopia de fluorescência. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o processo de visualização do fluxo do líquido cefalorraquidiano (LCR) no cérebro de um camundongo usando imagens de fluorescência. Um traçador fluorescente é injetado na cisterna magna (MC), permitindo que seu movimento com o LCR seja rastreado através dos espaços subaracnóideo e perivascular. A imagem de lapso de tempo captura a jornada do traçador, destacando sua distribuição no tecido cerebral por meio de arteríolas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparando a cânula da cisterna magna, a placa da cabeça e o suporte da cabeça

1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e placas da cabeça antes da cirurgia.
   NOTA: Os traçadores fluorescentes são entregues diretamente no LCR por meio de uma canulação da cisterna magna.
2. Resumidamente, usando uma chave de agulha, quebre a ponta de uma agulha de 30G x 12.7 mm (1/2 polegada), 3/4 do caminho para baixo, e coloque a ponta romba da agulha em uma extremidade do tubo de polietileno 10 (PE10) (cerca de 45 cm de comprimento). Certifique-se de que apenas o chanfro esteja saindo da borda da tubulação PE10.
3. Quebre 1/4 da extremidade chanfrada de outra agulha 30G e coloque a extremidade romba da agulha restante na outra extremidade do tubo PE10, com a trava Luer de plástico ainda presa.
4. Encha uma seringa de vidro de 100 μL com LCR artificial estéril (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM de glicose e 26 mM NaHCO₃).
5. Encaixe a seringa na extremidade da linha e encha-a com aCSF até atingir a ponta da agulha chanfrada. É importante que a seringa seja preenchida com aCSF e não com ar, pois uma coluna de ar é mais propensa a volumes de infusão variáveis.
6. Para experimentos crônicos, deixe a linha cheia de aCSF e pule a Etapa 1.7.
7. Para experimentos agudos, coloque a seringa em uma bomba de infusão e retire aproximadamente 5 mm de ar, o que impedirá a mistura. Em seguida, retire o volume total de traçador (s) desejado para o experimento (recomenda-se 20% extra devido a perdas de espaço morto).
   NOTA: O tubo PE10 deve ser longo o suficiente para que a bolha de ar não entre no manguito de plástico da seringa de vidro ao carregar o traçador. Para um experimento típico, o protocolo usa 10 μL de albumina de soro bovino conjugada a Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluída em aCSF a 0,5%.
8. Confirme se a placa da cabeça se encaixa no suporte da cabeça e se é do tamanho certo para o mouse que está sendo usado. Os marcadores anatômicos para garantir isso são: a borda superior da janela se alinha com a linha interocular e a borda posterior fica rostral à crista occipital.
   NOTA: As placas de cabeça de aço inoxidável podem ser esterilizadas e reutilizadas. A maioria das misturas de cianoacrilato pode ser removida com uma solução de acetona.

2. Procedimento cirúrgico

1. Pesar e anestesiar o camundongo (por exemplo, cetamina / xilazina; 100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg de xilazina; ip).
2. Quando o mouse não responder mais a um beliscão no dedo do pé, umedeça o pescoço e a cabeça com água estéril e faça a barba usando uma tesoura. Depois que a área estiver raspada, limpe-a com um cotonete embebido em álcool novamente para remover qualquer resíduo de pelo.
   NOTA: Umedecer o pelo antes de cortar reduz drasticamente a quantidade de pelos na janela de imagem após a incisão.
3. Coloque o mouse em uma estrutura estereotáxica em cima de uma almofada com temperatura controlada e aplique pomada oftálmica de petróleo nos olhos do mouse para garantir que eles não sequem.
4. Limpe a pele exposta com um cotonete de clorexidina. Após 2 min, remova a clorexidina com um pano embebido em álcool. Por fim, aplique uma solução de iodo que pode ser deixada secar.
5. Injete analgesia subcutânea (0,25% de Bupivacaína HCl) na parte superior do crânio e pescoço.
6. Começando na parte do pescoço que cobre a crista occipital, faça um corte na linha média na pele sobrejacente e continue rostralmente em direção à linha interorbital. Incisar lateralmente à borda onde o músculo temporal se insere no crânio. Remova toda a pele da incisão fusiforme para expor os ossos frontal e parietal.
   CUIDADO: O seio retroorbital fica caudal aos olhos e grandes ramos da veia facial posterior ficam rostral ao pavilhão auricular. Tenha cuidado ao fazer a incisão para poupar essas estruturas. Se isso ocorrer, pare o sangramento mantendo a hemostasia com um cotonete estéril por vários minutos e continue.
7. Irrigue o crânio com solução salina estéril e limpe a superfície com cotonetes para que fique livre de detritos e cabelos, pois eles interferirão na qualidade da imagem. A transparência do crânio é melhor preservada deixando o periósteo e a fáscia sobrejacente intactos.
   NOTA: Se essas estruturas forem removidas acidentalmente, o crânio pode ficar seco e opaco com o tempo. Umedeça novamente com aCSF ou use uma mistura de óleo de parafina e glicerol para reduzir a refletância do crânio em experimentos agudos.
8. Prossiga para inserir a cânula cisterna magna.
9. Depois de inserir a cânula CM, aplique uma mistura de cimento dentário com cola de cianoacrilato no lado ventral da placa da cabeça ao redor da borda e coloque-a no crânio de modo que a borda anterior da placa da cabeça se alinhe com a ponta posterior do osso nasal e a borda posterior se alinhe com a face anterior do osso interparietal, certificando-se de que a sutura sagital (linha média) esteja centralizada e reta em relação à janela (Figura 1B).
10. Fixe a posição da placa principal usando algumas gotas de acelerador de cola. Preencha as lacunas restantes com a mistura de cimento e cure com acelerador.
    CUIDADO: Certifique-se de que o cianoacrilato não entre em contato com os olhos do mouse ou bloqueie a janela de imagem.
11. Cole a cânula CM na placa da cabeça para garantir que elas não se soltem durante o transporte ou quando o mouse acordar.
12. Para experimentos agudos, pule para a Etapa 2.16.
13. Para experimentos crônicos, aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato de secagem clara no crânio exposto, tomando cuidado para não criar bolhas, pois elas interferirão na imagem. A cola fornece proteção para o crânio e não interfere na imagem. Certifique-se de que a cola cubra o crânio exposto até a pele na borda da incisão.
14. Use uma braçadeira hemostática para segurar o tubo PE10 preenchido com aCSF a 2-3 cm do CM e corte a linha com uma ponta de cautério de alta temperatura. Depois de separado, alise o tubo PE10 derretido para vedar a cânula.
    CUIDADO: Certifique-se de não soltar o clamp até que a cânula tenha sido selada e confirme se não há vazamentos no tubo para evitar uma fístula de LCR.
15. Administre carprofeno (5 mg / kg a cada 24 h por 3 dias; intraperitoneal [i.p.] ou subcutâneo [s.c.]) e retorne o camundongo a uma gaiola de alojamento único com temperatura controlada e deixe-o se recuperar por pelo menos 24 h antes da imagem. Não deixe o rato sem vigilância até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. As janelas cranianas intactas permanecem estáveis por várias semanas. NOTA: O experimento crônico pode ser pausado aqui.
    CUIDADO: Algumas complicações pós-operatórias são: cefalohematoma/hematomas subgaleais, fístula liquórica e infecção.
16. Para experimentos agudos, coloque o mouse no suporte da cabeça usando a placa da cabeça para que o crânio fique em uma posição fixa. Certifique-se de verificar o nível de anestesia e coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse. O mouse agora está pronto para ser levado ao macroscópio.
    CUIDADO: Transporte cuidadosamente o mouse junto com a bomba de infusão em um carrinho. Se a canulação do CM for desalojada, causará uma queda na pressão intracraniana e qualquer vazamento de LCR alterará os resultados experimentais.

3. Preparando o mouse para a imagem

NOTA: O protocolo varia dependendo se o experimento de imagem será realizado em um camundongo anestesiado (comece na Etapa 3.1) ou acordado (comece na Etapa 3.2).

1. Camundongos anestesiados
   1. Coloque o suporte da cabeça no estágio do macroscópio, certificando-se de que não haja dobras na linha da bomba de seringa para a cânula CM e que não esteja esticada, pois isso pode afetar a infusão do marcador.
   2. Observe a frequência respiratória e a coloração rosada das mucosas, indicando boa oxigenação. Injete solução salina por via subcutânea para garantir o nível de hidratação, se necessário. Verifique se o animal está suficientemente anestesiado e retome a dose, se necessário.
   3. Ligue a câmera do macroscópio e o diodo emissor de luz (LED) e inicie o modo LIVE.
   4. Confirme a ampliação do campo de imagem para que a sutura nasofrontal na parte superior do campo e a sutura lambdoide na parte inferior possam ser claramente visualizadas, com a sutura sagital paralela e centralizada no meio da imagem (Figura 1C). Uma vez no lugar, prenda o suporte da cabeça ao macroscópio stage com fita adesiva.
   5. Concentre o macroscópio no crânio exposto. Apesar dos macroscópios terem uma profundidade de campo relativamente grande, a curvatura do crânio do camundongo permite apenas que uma área específica esteja em foco. Os melhores resultados são obtidos quando o plano focal está localizado nas faces laterais dos ossos parietais posteriores às suturas coronais.
      NOTA: Esta é a localização das artérias cerebrais médias (ACM), onde ocorre a maior parte do influxo liquórico (Figura 1D, E).
2. Camundongos acordados
   1. Antes da sessão de imagem, deixe os animais se recuperarem por pelo menos 24 horas da cirurgia da placa da cabeça. Períodos de recuperação mais longos (5-7 dias) também são recomendados. Durante esse tempo, treine o mouse para que a cabeça fique fixada no palco no tubo de contenção por 0,5-1 h por dia durante o período de recuperação.
      NOTA: A habituação permite que o mouse seja preso ao suporte da cabeça sem anestesia e reduz o estresse e a ansiedade durante o experimento real. Se isso não for viável e a anestesia não interferir no experimento, uma dose de indução de um anestésico inalatório (por exemplo, isoflurano a 2% a uma taxa de fluxo de O2 de 1-2 L / min) pode ser usada para prender rapidamente o camundongo ao estágio principal.
   2. Depois que o mouse estiver fixado no suporte da cabeça e no tubo de retenção, siga as etapas 3.1.1-3.1.5.

4. Infusão de traçadores fluorescentes de LCR

1. Canulação aguda do CM
   1. Como o traçador já foi carregado na cânula antes de ser colocado na cisterna magna na Etapa 1.6, ajuste a bomba de infusão para a taxa e o volume desejados. Os paradigmas de infusão usados rotineiramente são 5-10 μL a 1-2 μL / min, mas esses parâmetros podem ser ajustados dependendo do experimento específico ou do tamanho e idade do animal.
2. Canulação crônica do CM
   1. Antes de iniciar a sessão de imagem, siga as etapas 1.2-1.7 para experimentos agudos para preparar a linha de infusão para administrar os traçadores.
   2. Uma vez que a linha esteja preparada, usando uma pinça hemostática, corte a extremidade selada da cânula de MC crônica. Retire a agulha da linha preparada na Etapa 4.2.1 e insira-a suavemente na cânula. Solte a pinça e, usando a bomba de seringa, avance o traçador de LCR na taxa de infusão desejada (por exemplo, 2 μL/min) para o experimento até que o traçador atinja a agulha implantada no CM.
      CUIDADO: Se a agulha perfurar o tubo ao conectar a linha, remova a agulha, corte o segmento perfurado e repita esta etapa. Qualquer rasgo na tubulação PE10 causará um vazamento e afetará os resultados do experimento.

5. Configurando a sessão de imagem

1. Com base no traçador fluorescente que está sendo infundido, determine o comprimento de onda de excitação e o tempo de exposição para cada canal. Escolha o menor tempo de exposição necessário para visualizar o traçador para maximizar a resolução temporal da imagem de lapso de tempo. Este tempo de exposição será utilizado para todos os experimentos subsequentes com o objetivo de comparar o transporte de LCR entre diferentes animais.
   NOTA: Uma dica é usar o traçador na linha CM para ajustar o tempo de exposição. Embora essa seja uma primeira abordagem útil, ela deve ser otimizada ao longo do tempo.
2. Escolha a duração do experimento e os intervalos em que as imagens serão adquiridas. Os experimentos normalmente duram entre 30-60 minutos, dependendo de qual fase do transporte glinfático é de interesse. Taxas de quadros de 1 quadro/min e mais rápidas são suficientes para a maioria dos experimentos.
3. Defina o nome do arquivo e o diretório de salvamento.
4. Se a imagem for coletada além da aquisição simultânea de outras variáveis (por exemplo, eletrocardiograma, pressão arterial, eletrofisiologia), o macroscópio e a bomba podem ser programados para serem acionados com software de aquisição de dados. Verifique se a função de disparo no macroscópio está correta antes de passar para a próxima etapa.

6. Experimento de imagem óptica transcraniana

1. Inicie a infusão do traçador e a imagem ao mesmo tempo.
2. Verifique rotineiramente a cânula CM e a tubulação PE10 quanto a sinais de vazamento. Se houver algum traçador vazando no MC, os resultados deste experimento devem ser excluídos.
   NOTA: Se o traçador começar a se acumular no cerebelo e não percorrer a via glinfática das artérias cerebrais médias (ACM), é provável que a cânula do MC tenha sido injetada no cerebelo. Esses dados não devem ser incluídos.
3. Para experimentos agudos, após a conclusão do experimento, remova o mouse do microscópio e verifique se ele ainda está adequadamente anestesiado. Decapite rapidamente o rato e colha o tecido cerebral. Imersão-fixe o cérebro em paraformaldeído a 4% (PFA) durante a noite a 4 °C.
   1. Para experimentos crônicos, uma vez concluída a imagem, remova a linha CM da cânula, lave com aCSF estéril e feche novamente a cânula CM com uma ponta de cautério de alta temperatura. Remova o mouse do suporte de cabeça e retorne-o à sua gaiola. Repita esse processo até que não seja necessária mais imagens e, em seguida, siga a Etapa 6.3.

Resultados

Figura 1. Imagem macroscópica transcraniana. (A) Esquema da configuração da imagem macroscópica. (B) Vista dorsal da posição da placa da cabeça no crânio. O osso interparietal e os ossos nasal, frontal e par...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 μL Seringa à prova de gás modelo 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Cimento Dental em Pó	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofeno			Universidade de Rochester Vivarium
Clorexidina	Prevantics	B10800
Câmera CMOS	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Placa de Cabeça	Universidade de Rochester	Sem catálogo #	Feito sob medida na oficina mecânica da Universidade de Rochester
Cautery de alta temperatura	Bovie Medical Corporation	AA01
Acelerador Insta-set	Bob Smith Industries	BSI-151
Isoflurano - Fluriso	Vet One	502017	Universidade de Rochester Vivarium
Ketamine			Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	Sem catálogo #, veja o link nos comentários	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Fita cirúrgica Micropore	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldeído	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polietileno .011" x .024" por pé, 100 pés. contínuo	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Bomba 11 Elite Infusão Apenas Seringa Dupla	Aparelho Harvard	70-4501
POMADA VET PURALUBE	Dechra
Puritan PurSwab Bastões de Limpeza com Ponta de Algodão	Fisher Scientific	22-029-553
Microscópio de Zoom Macro de Pesquisa	Placa de Suporte de Cabeça Simples Olympus	MVX10
(para ratos)	Narishige Agulhas de	MAG-1
, BD Medical	VWR	BD305106
Almofadas de preparação de álcool estéril	Fisher Scientific	22-363-750
LED ajustável	PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine			University of Rochester Vivarium

uso único da International USA Inc