Indução optogenética de depressão de longo prazo para suprimir o comportamento de busca de narcóticos em ratos

Resumo

Fonte: Rich, M. T., et al. Usando optogenética para reverter a neuroplasticidade e inibir a busca de cocaína em ratos. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o uso da optogenética para induzir depressão de longo prazo (LTD) nas sinapses do núcleo geniculado medial para a amígdala lateral (MGN-LA), enfraquecendo o comportamento de busca de narcóticos induzido por sugestão em um modelo de rato. O rato, implantado cirurgicamente com fibras ópticas e transduzido viralmente para expressar canais iônicos sensíveis à luz, sofre estimulação optogenética com pulsos ópticos de baixa frequência, desencadeando a liberação de neurotransmissores e o enfraquecimento sináptico. Esse processo reduz a transmissão sináptica do MGN-LA por meio da internalização do receptor de neurotransmissores, interrompendo a associação entre pistas e comportamento de busca de drogas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Cateterismo intravenoso de roedores, entrega de vírus e implantação de fibra óptica

1. Prepare os animais para a cirurgia.
   1. Anestesiar totalmente os ratos com o anestésico de escolha com base nas diretrizes institucionais. Uma opção é o cloridrato de cetamina (87,5-100 mg/kg, intramuscular [i.m.]) e o cloridrato de xilazina (5 mg/kg, i.m.). Certifique-se de que o rato esteja totalmente anestesiado, verificando a falta de reflexo de pinça do dedo do pé.
      CUIDADO: A cetamina é uma substância controlada que deve ser manuseada de acordo com as diretrizes institucionais.
      NOTA: As injeções intramusculares de anestésicos são usadas neste estudo, pois produzem uma indução anestésica mais rápida e confiável do que a injeção intraperitoneal. Monitore continuamente a respiração e a capacidade de resposta do rato e forneça suporte térmico durante toda a cirurgia.
   2. Raspe uma grande área das costas do rato (parte superior das costas logo acima das omoplatas até o meio das costas), bem como a área do pescoço abaixo do membro anterior direito e o couro cabeludo.
   3. Coloque o rato na área cirúrgica e aplique puralube (lágrimas artificiais) nos olhos. Injete um volume de peso corporal de carprofeno (analgésico) por via subcutânea (subcutâneo [s.c.]) através da pele da parte superior das costas e, em seguida, injete 5 mL de solução de Lactato Ringer s.c. através da pele da parte inferior das costas.
   4. Higienize todos os locais cirúrgicos umedecendo um pedaço de gaze estéril com betadina e limpando-o na área cirúrgica raspada com movimentos circulares. Em seguida, repita o processo com etanol 70%. Repita este ciclo alternado três vezes.
2. Realize o implante do cateter intravenoso de acordo com os protocolos publicados anteriormente.
   NOTA: Um campo cirúrgico não é usado durante esta cirurgia para evitar irritação durante o implante do cateter. Esterilize todos os instrumentos e equipamentos antes de usar. Use luvas estéreis e troque as luvas se alguma superfície não estéril for contatada.
3. Imediatamente após o implante do cateter, prenda o rato em uma estrutura estereotáxica para realizar injeções de vírus adeno-associado (AAV).
   1. Aplique uma injeção subcutânea (s.c.) de lidocaína a 2% (0,2-0,3 mL) no couro cabeludo como anestésico local.
      NOTA: O anestésico local não é usado durante o implante do cateter intravenoso para evitar alterações nos resultados cirúrgicos.
   2. Conecte uma cânula de injeção de aço inoxidável de calibre 26 a uma seringa Hamilton cheia de 1 μL de solução concentrada de AAV: AAV5-hSyn-tdTomato ou AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      NOTA: oChIEF é uma variante da opsina canalrodopsina sensível à luz azul (ChR2), que pode responder a uma ampla faixa de frequências e, portanto, tem utilidade para os experimentos de depressão de longo prazo (LTD) de baixa frequência discutidos neste protocolo, mas também para experimentos de potenciação de longo prazo (LTP) de alta frequência. A construção oChIEF foi doada pelo Dr. Roger Tsien e processada para embalagem e purificação pelo Duke Viral Vector Core. São necessárias pelo menos 3-4 semanas entre o dia da injeção e o dia da indução do LTD para permitir a expressão ideal do vírus no núcleo geniculado medial dos terminais do axônio do tálamo (MGN).
      CUIDADO: Geralmente, o AAV é considerado um organismo de Nível de Biossegurança 1 (BSL-1), com baixo risco de autoinfecção, a menos que um vírus auxiliar seja usado em sua produção. Seu uso requer a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), e equipamentos de proteção individual (EPI) adequados devem ser usados em todos os momentos, de acordo com as diretrizes institucionais para limitar a exposição desnecessária.
   3. Usando um bisturi, faça uma incisão de 0,5 mm da frente para trás do crânio e remova o tecido sobrejacente para expor a superfície do crânio.
   4. Nivele a cabeça do rato no eixo anterior/posterior e zero coordenadas estereotáxicas para bregma.
   5. Faça três pequenos furos no crânio usando uma ferramenta Dremel equipada com uma pequena broca. Use uma chave de fenda para montar firmemente os parafusos de aço inoxidável (M2x4 965-A2) no lugar.
      NOTA: Os parafusos são necessários para a fixação adequada do cimento dentário e a criação de tampas de cabeça resistentes e duradouras. A posição dos parafusos deve ser espalhada pelo eixo ântero-posterior do crânio e longe do local da injeção de AAV.
   6. Faça furos bilaterais para injeção de AAV com base nas coordenadas do Atlas do Cérebro de Ratos (Watson e Paxinos) para a porção medial do núcleo geniculado medial (MGN); em mm do bregma, ântero-posterior (AP): -5,4; mediolateral (ML): ±3,0; dorsoventral (DV): -6,6. Abaixe lentamente as cânulas de injeção (4 mm/min) até posicioná-las no MGN. Injete solução concentrada de AAV a uma taxa de 0,1 μL / min.
   7. Deixe a cânula de injeção no lugar por 5 minutos após a conclusão das infusões para permitir a difusão para longe da cânula e, em seguida, retire lentamente a cânula do cérebro.
4. Imediatamente após as injeções de vírus, continue a implantar fibras ópticas direcionadas aos terminais MGN-LA.
   1. Use uma ferramenta Dremel para fazer furos bilaterais para implantes de fibra óptica direcionados à amígdala lateral (em mm de bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. Use uma pinça para agarrar a ponteira do implante de fibra óptica e fixá-la aos adaptadores estereotáxicos para que fiquem firmemente presos no lugar.
   3. Abaixe lentamente as fibras a uma taxa de 2 mm / min, até que a ponta da fibra fique na porção dorsal do AE (dorsoventral [VD]: -7,9 mm).
   4. Prenda as ponteiras ao crânio primeiro usando uma fina camada de adesivo instantâneo Loctite, seguido de cimento dentário e cubra as ponteiras com mangas de ponteira de 1,25 mm de diâmetro e tampas contra poeira.
      NOTA: A escolha do adesivo para prender as ponteiras ao crânio deve ser aprovada pelo comitê local ou institucional de cuidados e uso de animais. Loctite é usado para este estudo para prender de forma confiável as ponteiras ao crânio após tentativa e erro com vários adesivos; no entanto, alternativas disponíveis podem ser consideradas.
5. Após procedimentos cirúrgicos, os ratos domésticos individualmente fornecem acesso gratuito a comida e água. Fornecer cuidados pós-operatórios consistentes com as diretrizes institucionais. Lave os cateteres diariamente com solução salina contendo gentamicina (5 mg/mL) e heparina (30 USP/mL) para manter a permeabilidade. Pelo menos 5 dias após a cirurgia e 24 horas antes do início dos experimentos comportamentais, a comida restringe os ratos a ~ 90% de seu peso de alimentação livre.

2. Autoadministração de cocaína em roedores e extinção da alavanca instrumental

NOTA: Todos os procedimentos comportamentais são conduzidos em câmaras de condicionamento operante padrão, equipadas com duas alavancas retráteis em uma parede, uma luz de estímulo acima de cada alavanca, um gerador de tom, uma luz doméstica e uma bomba de infusão.

1. Submeter ratos a sessões diárias de treinamento de autoadministração de cocaína de 1 h (2 mg/mL) sob um cronograma de reforço de proporção fixa 1 (FR1).
   1. Coloque os ratos em uma câmara operante todos os dias e permita que os ratos pressionem a alavanca. Pressionar a "alavanca ativa" designada (contrabalançada entre as alavancas esquerda e direita) resulta em uma infusão de cocaína (1,0 mg / kg / infusão) e uma apresentação de 10 s de uma sugestão composta de luz e tom. Um toque na 'alavanca inativa' designada não tem efeitos programados.
   2. Continue os experimentos de autoadministração por pelo menos 10 dias e até que os ratos ganhem com sucesso pelo menos 8 infusões / dia em 3 dias consecutivos. O não cumprimento dos critérios de aquisição até o dia 20 resulta na exclusão do estudo.
2. Depois que os critérios de aquisição forem atendidos com sucesso, submeta os ratos a sessões de extinção instrumental de 1 h por 6-10 d.
   1. Coloque os ratos em câmaras operante e permita que os ratos pressionem livremente. No entanto, as respostas nas alavancas ativas e inativas não têm consequências programadas.
   2. Faça com que os ratos continuem a extinção instrumental diariamente até que ocorra uma média de < 25 pressionamentos de alavanca em dois dias consecutivos.

3. Indução optogenética in vivo de LTD

NOTA: Os experimentos de inibição optogenética ocorrem 24 horas após o último dia de extinção instrumental.

1. Conecte os cabos de conexão a um diodo laser azul de 473 nm por meio de uma junta rotativa suspensa acima de uma gaiola de alojamento de roedor padrão e limpa com a tampa removida. Essa configuração permite que os roedores se movam livremente pela gaiola durante a estimulação optogenética.
2. Ligue o diodo laser de acordo com as instruções de operação e conecte-o a um gerador de pulsos. Ajuste as configurações para que, quando ligado, o rato receba 900 pulsos de luz de 2 ms a 1 Hz.
   CUIDADO: A proteção adequada para os olhos deve ser usada o tempo todo durante a operação do laser.
3. Meça a intensidade da luz através do patch cord usando um sensor de luz. Ajuste a intensidade do laser para que a saída de luz através do patch cable seja de ~5-7 mW.
4. Coloque os ratos em uma gaiola limpa. Remova as tampas contra poeira e as mangas da ponteira, expondo as ponteiras. Conecte os patch cords bilateralmente aos implantes de fibra óptica. Permita que os ratos explorem o ambiente por 3 minutos antes da indução do LTD.
5. Ligue o gerador de pulso para iniciar a estimulação optogenética.
   NOTA: Embora improvável, se os ratos apresentarem alguma reação adversa à estimulação, o experimento será imediatamente encerrado e os ratos serão devidamente sacrificados com base nas diretrizes institucionais.
6. Após a indução LTD, mantenha os ratos na gaiola por 3 minutos e, em seguida, coloque-os de volta em suas gaiolas domésticas.
7. Para experimentos de controle, use o mesmo procedimento de estimulação em ratos que expressam o vírus de controle AAV5-tdTomato. Para experimentos simulados, conecte um patch cord à fibra óptica de ratos que expressam o vírus AAV5-oChIEF, mas nenhuma estimulação é fornecida durante uma sessão de 15 minutos.

4. Teste o efeito da estimulação optogenética na busca de cocaína induzida por sugestão

1. 24 h após as estimulações optogenéticas in vivo, coloque os ratos de volta nas câmaras de condicionamento operante. Os ratos são submetidos a uma sessão de reintegração induzida por sugestão padrão de 1 h para avaliar o comportamento de busca de cocaína.
   NOTA: Durante a reintegração induzida por sugestão, uma resposta na alavanca ativa produz uma apresentação de 10 s da sugestão associada à cocaína, mas nenhuma infusão de cocaína.
2. Faça um segundo teste de reintegração pelo menos 1 semana após o primeiro teste para determinar se a indução optogenética LTD resulta em uma supressão de longo prazo da busca de cocaína

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