Imagem de tecido profundo de um cérebro de peixe-zebra usando um microscópio de fluorescência de três fótons

Abstract

Fonte: Hontani, Y., et al. Microscopia de fluorescência de três fótons de tecido profundo em cérebro intacto de camundongo e peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra a configuração e execução de imagens de três fótons em um cérebro de peixe-zebra anestesiado. O protocolo permite a visualização de tecidos profundos de neurônios marcados com fluorescência, revelando atividade neuronal em tempo real e estruturas para aplicações de pesquisa em neurociência.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Imagens intravitais no cérebro do peixe-zebra
   NOTA: Para localizar corretamente o cérebro do peixe sob a lente objetiva, uma câmera CCD (dispositivo de carga acoplada secundária) é usada no mesmo caminho que a luz de excitação para imagens de campo amplo.
   
   1. Configure o microscópio e calibre a potência.
   2. Coloque uma objetiva de baixa ampliação (normalmente 4x) no microscópio.
   3. Coloque a placa de Petri contendo os peixes e os tubos sob o microscópio.
   4. Use uma fonte de luz de diodo emissor de luz (LED) para iluminar a placa de Petri.
   5. Abra o modo Câmera do software de aquisição de imagem (Figura 1).
   6. Clique em Ao vivo.
   7. Escolha o canal A no lado direito da tela.
   8. Ajuste as configurações do histograma para ver a imagem com clareza.
      NOTA: Elas precisam ser atualizadas conforme necessário.
   9. Defina a configuração do motor no controlador do motor para Base.
   10. Abaixe a objetiva até que o peixe fique visível.
       NOTA: Certifique-se de que a lente objetiva não faça nenhum contato físico com a cabeça.
   11. Coloque o centro da cabeça do peixe no centro do campo de visão.
   12. Mova o objetivo para cima e para longe da cabeça do peixe.
   13. Substitua a lente objetiva de baixa ampliação pela lente objetiva de alta abertura numérica (NA) para 3PM (microscopia de três fótons).
       NOTA: A lente de baixa ampliação e a lente objetiva de alta abertura numérica não precisam ser parfocais, mas devem estar próximas o suficiente para garantir que o peixe esteja dentro do campo de visão da lente objetiva de alta NA.
   14. Abaixe lentamente a lente objetiva, garantindo que a objetiva não faça nenhum contato físico com a cabeça. No software da câmera CCD, pare de mover a objetiva quando o topo da cabeça estiver visível. Defina a localização z para 0 μm.
       NOTA: Certifique-se de que não haja bolhas de ar sob a lente objetiva ao usar uma objetiva de imersão em água.
   15. Desligue a fonte de luz LED e feche a cortina escura ao redor do sistema.
   16. Defina o software de aquisição de imagem para o modo Multiphoton GG para imagens 3P e defina a potência sob a lente objetiva para menos de 1 mW (com taxa de repetição de pulso de ~ 1 MHz).
   17. Altere o botão de configuração do motor de Base para Objective no controlador do motor.
   18. Apague as luzes da sala.
   19. Ligue os tubos fotomultiplicadores (PMTs) e abra o obturador da fonte de excitação 3PM. Certifique-se de que um contorno do osso apareça no canal de sinal de fluorescência devido à autofluorescência e no canal de sinal de geração de terceiro harmônico (THG) devido ao THG do osso (Figura 1C).
   20. Realize imagens em diferentes profundidades, aumentando os níveis de potência ao criar imagens mais profundas.

Results

Figura 1: Capturas de tela representativas para imagens intravitais em peixes (seção 1 do protocolo). (UMA) Modo de câmera view do software de aquisição de imagem com lente objetiva 4x no lugar. Os principais recursos do sof...

Materials