Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Marcação de células tumorais via retrovírus que expressa proteína fluorescente verde
NOTA: A microscopia de lapso de tempo para análise da migração de células tumorais requer marcação fluorescente estável e de longo prazo das células dentro da cultura de fatias. O uso de retrovírus é sugerido porque ele infecta seletivamente as células em divisão, enriquecendo assim a marcação fluorescente dentro da população de células tumorais, em oposição à microglia ou outros tipos de células presentes na fatia. A padronização da infecção sugere que um título viral de 104 UFC/μL resulta em expressão suficiente de proteína fluorescente verde para o rastreamento e análise da migração celular. O aumento do título viral, o uso de vírus não seletivos (ou seja, adenovírus, lentivírus) ou outros meios de rotular todas as células podem impedir a identificação de limites celulares claros durante a migração, complicando assim a análise. O uso de marcadores fluorescentes alternativos pode ser utilizado e otimizado conforme necessário.
- Obtenha retrovírus para infecção de fatias tumorais por meio de protocolos padrão5,14 ou de uma fonte disponível comercialmente. Diluir o sobrenadante viral adicionando o volume apropriado a um meio neuronal não suplementado para atingir um título viral de 104 UFC (unidades formadoras de colônias) / μL.
- Entre 7 a 10 dias de cultura, infectar as culturas de fatias tumorais de interesse com 5 a 10 μL de vírus (104 UFC/μL). Coloque o vírus suavemente gota a gota na superfície de cada fatia de tecido. Diminua o volume do sobrenadante adicionado se a fatia flutuar na superfície da pastilha. Retorne as placas contendo culturas de fatias para uma incubadora.
- Avalie as fatias em busca de células tumorais marcadas a partir de 24 h após a infecção viral. Esse atraso de tempo varia de acordo com a incorporação viral e a cinética da expressão gênica de fluorescência. Para as construções virais usadas aqui, foram necessárias 72 h para observar um sinal fluorescente robusto com um microscópio de epifluorescência padrão.
NOTA: Raramente, as fatias exibem uma distribuição predominantemente periférica de células marcadas com vírus, o que pode complicar a imagem confocal. Para evitar essa complicação, tente reduzir a espessura da fatia e a variação da espessura na fatia. Se a cultura de fatias tiver uma região mais espessa perto do centro, isso pode impedir a penetração adequada de nutrientes, limitando assim a população de células tumorais em divisão ativa. Um ensaio qualitativo para rastrear essa complicação é a adição de um reagente de corante de tetrazólio (ou seja, MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio)) ao meio de cultura em fatias. As áreas da fatia que não ficam azuis após a adição do reagente indicam falta de atividade metabólica e comprometimento da saúde da fatia.
2. Imagem confocal de varredura a laser de fóton único com lapso de tempo da migração de células tumorais
NOTA: Após a transdução bem-sucedida e a confirmação da saúde da cultura, as células podem ser visualizadas sob condições de controle, seguidas por um período igual de imagem sob condições de tratamento. Usando este protocolo, as células foram fotografadas e rastreadas com sucesso por 12 horas em cada condição. No entanto, períodos mais curtos ou mais longos de imagem e manipulação ambiental também podem ser informativos.
- Carregando o microscópio
- Antes de fazer a imagem, coloque 1 mL de meio de fatia fresca em um prato com fundo de vidro.
- Deixe o meio no prato com fundo de vidro se equilibrar em uma incubadora por 15 min.
NOTA: Neste ponto, agentes de marcação solúveis, como lectinas conjugadas fluorescentemente (ou seja, Isolectina IB4 para marcação de microglia) ou pontos quânticos conjugados com ligantes, podem ser adicionados ao meio de cultura de fatias para identificação de subpopulações celulares durante a imagem. - Transfira o inserto a ser fotografado para um prato com fundo de vidro usando uma pinça estéril em uma capela de fluxo laminar. Transporte o prato para o microscópio stage.
- Mantenha as culturas de fatias a 37 ° C e 5% de atmosfera de CO2 em uma incubadora de microscópio selada. Utilize umidificação estéril de H2O da câmara de incubação, se disponível, para evitar a evaporação excessiva do meio (especialmente importante para experimentos de imagem mais longos).
- Utilize um microscópio confocal com uma objetiva de ar de longa distância de trabalho de 10X e excitação a laser para fóton único e/ou multifóton. nota: Certifique-se de que a lente objetiva do microscópio forneça uma distância de trabalho adequada. Como resultado da altura adicional da incubadora de palco, prato de fundo de vidro e inserto de cultura de tecidos, as objetivas de longa distância de trabalho são críticas.
- Prenda a placa inferior de vidro, remova a tampa plástica da placa de Petri e cubra com uma membrana permeável a gás.
- Aquisição de imagem
- Use o microscópio para inspecionar visualmente a fatia e localize um campo adequado com densidade adequada de células tumorais marcadas com fluorescência entre a borda da fatia e o centro. Evite campos de imagem na borda da fatia, devido ao aumento da suscetibilidade de deslocamentos de tecido durante a imagem. Harpas de corte de tecido podem ser empregadas para limitar essa mudança.
- Use o software de imagem no modo de análise multidimensional para definir os limites da primeira (inferior) e da última (superior) pilha Z, de modo que todas as posições a serem visualizadas contenham um sinal celular fluorescente visível. A aquisição de imagens através de 150 a 200 μm da fatia, com um passo Z constante de 10 μm, forneceu resolução adequada para rastrear os caminhos das células (isso pode ser ajustado para as necessidades individuais de imagem).
- Se o microscópio tiver uma platina motorizada, certifique-se de que haja tempo adequado para cada aquisição da pilha Z. Defina o intervalo de tempo entre as aquisições para igualar o tempo de varredura por posição x número de posições para a imagem (ou seja, regiões tumorais com imagem).
NOTA: Para excitação simultânea dos fluoróforos verde e vermelho, utilize um programa de varredura de linha a laser de linha dupla, com excitação simultânea de 488 nm e 633 nm. O comprimento de onda da excitação do laser selecionado varia de acordo com as proteínas fluorescentes individuais expressas. - Mantenha a potência do laser uniforme e as configurações de orifício confocal entre as regiões tumorais imageadas. Utilize a configuração de potência do laser mais baixa necessária para demarcar claramente os corpos e processos das células tumorais para limitar a fototoxicidade. Unidades de parâmetros de imagem específicos (ou seja, configurações de potência e orifício confocal) variam de acordo com as especificações do microscópio e da fonte de laser.
- Compense a evaporação potencial do meio adicionando 2 a 3 etapas de pilha Z "buffer" nos planos focais que avançam em direção ao objetivo. Isso evita efetivamente que o tecido saia da faixa de aquisições da pilha Z no plano vertical.