Imagem da migração de células tumorais em tecido de glioblastoma usando microscopia confocal de varredura com lapso de tempo

Resumo

Fonte: Parker, J. J., et al. Um modelo de cultura de fatias organotípicas de glioblastoma humano para estudo da migração de células tumorais e efeitos específicos do paciente de medicamentos anti-invasivos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo mostra a imagem de fatias de tecido de glioblastoma expressando proteína fluorescente verde (GFP) por meio de microscopia confocal. Imagens de alta resolução são capturadas em intervalos consistentes para rastrear o movimento e a direção das células tumorais.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Marcação de células tumorais via retrovírus que expressa proteína fluorescente verde

NOTA: A microscopia de lapso de tempo para análise da migração de células tumorais requer marcação fluorescente estável e de longo prazo das células dentro da cultura de fatias. O uso de retrovírus é sugerido porque ele infecta seletivamente as células em divisão, enriquecendo assim a marcação fluorescente dentro da população de células tumorais, em oposição à microglia ou outros tipos de células presentes na fatia. A padronização da infecção sugere que um título viral de 10⁴ UFC/μL resulta em expressão suficiente de proteína fluorescente verde para o rastreamento e análise da migração celular. O aumento do título viral, o uso de vírus não seletivos (ou seja, adenovírus, lentivírus) ou outros meios de rotular todas as células podem impedir a identificação de limites celulares claros durante a migração, complicando assim a análise. O uso de marcadores fluorescentes alternativos pode ser utilizado e otimizado conforme necessário.

1. Obtenha retrovírus para infecção de fatias tumorais por meio de protocolos padrão5,14 ou de uma fonte disponível comercialmente. Diluir o sobrenadante viral adicionando o volume apropriado a um meio neuronal não suplementado para atingir um título viral de 10⁴ UFC (unidades formadoras de colônias) / μL.
2. Entre 7 a 10 dias de cultura, infectar as culturas de fatias tumorais de interesse com 5 a 10 μL de vírus (10⁴ UFC/μL). Coloque o vírus suavemente gota a gota na superfície de cada fatia de tecido. Diminua o volume do sobrenadante adicionado se a fatia flutuar na superfície da pastilha. Retorne as placas contendo culturas de fatias para uma incubadora.
3. Avalie as fatias em busca de células tumorais marcadas a partir de 24 h após a infecção viral. Esse atraso de tempo varia de acordo com a incorporação viral e a cinética da expressão gênica de fluorescência. Para as construções virais usadas aqui, foram necessárias 72 h para observar um sinal fluorescente robusto com um microscópio de epifluorescência padrão.
   NOTA: Raramente, as fatias exibem uma distribuição predominantemente periférica de células marcadas com vírus, o que pode complicar a imagem confocal. Para evitar essa complicação, tente reduzir a espessura da fatia e a variação da espessura na fatia. Se a cultura de fatias tiver uma região mais espessa perto do centro, isso pode impedir a penetração adequada de nutrientes, limitando assim a população de células tumorais em divisão ativa. Um ensaio qualitativo para rastrear essa complicação é a adição de um reagente de corante de tetrazólio (ou seja, MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio)) ao meio de cultura em fatias. As áreas da fatia que não ficam azuis após a adição do reagente indicam falta de atividade metabólica e comprometimento da saúde da fatia.

2. Imagem confocal de varredura a laser de fóton único com lapso de tempo da migração de células tumorais

NOTA: Após a transdução bem-sucedida e a confirmação da saúde da cultura, as células podem ser visualizadas sob condições de controle, seguidas por um período igual de imagem sob condições de tratamento. Usando este protocolo, as células foram fotografadas e rastreadas com sucesso por 12 horas em cada condição. No entanto, períodos mais curtos ou mais longos de imagem e manipulação ambiental também podem ser informativos.

1. Carregando o microscópio
   1. Antes de fazer a imagem, coloque 1 mL de meio de fatia fresca em um prato com fundo de vidro.
   2. Deixe o meio no prato com fundo de vidro se equilibrar em uma incubadora por 15 min.
      NOTA: Neste ponto, agentes de marcação solúveis, como lectinas conjugadas fluorescentemente (ou seja, Isolectina IB4 para marcação de microglia) ou pontos quânticos conjugados com ligantes, podem ser adicionados ao meio de cultura de fatias para identificação de subpopulações celulares durante a imagem.
   3. Transfira o inserto a ser fotografado para um prato com fundo de vidro usando uma pinça estéril em uma capela de fluxo laminar. Transporte o prato para o microscópio stage.
   4. Mantenha as culturas de fatias a 37 ° C e 5% de atmosfera de CO₂ em uma incubadora de microscópio selada. Utilize umidificação estéril de H₂O da câmara de incubação, se disponível, para evitar a evaporação excessiva do meio (especialmente importante para experimentos de imagem mais longos).
   5. Utilize um microscópio confocal com uma objetiva de ar de longa distância de trabalho de 10X e excitação a laser para fóton único e/ou multifóton. nota: Certifique-se de que a lente objetiva do microscópio forneça uma distância de trabalho adequada. Como resultado da altura adicional da incubadora de palco, prato de fundo de vidro e inserto de cultura de tecidos, as objetivas de longa distância de trabalho são críticas.
   6. Prenda a placa inferior de vidro, remova a tampa plástica da placa de Petri e cubra com uma membrana permeável a gás.
2. Aquisição de imagem
   1. Use o microscópio para inspecionar visualmente a fatia e localize um campo adequado com densidade adequada de células tumorais marcadas com fluorescência entre a borda da fatia e o centro. Evite campos de imagem na borda da fatia, devido ao aumento da suscetibilidade de deslocamentos de tecido durante a imagem. Harpas de corte de tecido podem ser empregadas para limitar essa mudança.
   2. Use o software de imagem no modo de análise multidimensional para definir os limites da primeira (inferior) e da última (superior) pilha Z, de modo que todas as posições a serem visualizadas contenham um sinal celular fluorescente visível. A aquisição de imagens através de 150 a 200 μm da fatia, com um passo Z constante de 10 μm, forneceu resolução adequada para rastrear os caminhos das células (isso pode ser ajustado para as necessidades individuais de imagem).
   3. Se o microscópio tiver uma platina motorizada, certifique-se de que haja tempo adequado para cada aquisição da pilha Z. Defina o intervalo de tempo entre as aquisições para igualar o tempo de varredura por posição x número de posições para a imagem (ou seja, regiões tumorais com imagem).
      NOTA: Para excitação simultânea dos fluoróforos verde e vermelho, utilize um programa de varredura de linha a laser de linha dupla, com excitação simultânea de 488 nm e 633 nm. O comprimento de onda da excitação do laser selecionado varia de acordo com as proteínas fluorescentes individuais expressas.
   4. Mantenha a potência do laser uniforme e as configurações de orifício confocal entre as regiões tumorais imageadas. Utilize a configuração de potência do laser mais baixa necessária para demarcar claramente os corpos e processos das células tumorais para limitar a fototoxicidade. Unidades de parâmetros de imagem específicos (ou seja, configurações de potência e orifício confocal) variam de acordo com as especificações do microscópio e da fonte de laser.
   5. Compense a evaporação potencial do meio adicionando 2 a 3 etapas de pilha Z "buffer" nos planos focais que avançam em direção ao objetivo. Isso evita efetivamente que o tecido saia da faixa de aquisições da pilha Z no plano vertical.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, menos vermelho de fenol	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Suplemento (50X), Invitrogen sem soro	(Gibco)	17504-044
Penicilina-estreptomicina (10.000 U / mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Suplemento GlutaMAX	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamina (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nistatina Suspensão	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10.000 unidade/mL em DPBS, processado assepticamente, BioReagent, adequado para cultura de células
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Derrete a 65,5 C, Permanece fluido a 37 C e endurece rapidamente abaixo de 25 C.
Isolectina GS-IB4 de Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugado	Thermo Fisher (Sondas Moleculares)	I32450	Usado em meios para rotular Microglia / Macrófagos
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	Resina de ligação para concentração não ultracentrifugação de sobrenadantes virais
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	parte do Sistema Universal de Expressão Retroviral Retro-X
GP2-293 Células de embalagem viral	Clonetech	631530	parte do Sistema Universal de Expressão Retroviral Retro-X
Cola de Cianoacrilato (Super Cola)	Sigma-Aldrich	Z105899
Molde de Incorporação Peel-A-Way de Média Viscosidade (Quadrado - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Moldes para incorporação de amostras de tumor
Micro Espátulas de Aço Inoxidável	Fisher Scientific	S50823	Instrumento de curvatura 45 graus no pescoço da lâmina da colher
Curvado Fisherbrand Dissecando Pinças de Ponta Fina	Fisher Scientific	08-875
Lâmina de Barbear de Borda Única (Lâminas de Segurança Americanas)	Fisher Scientific	17-989-001	A borda da lâmina tem 0,009" de espessura. A tampa de borda romba crimpada é removida antes de carregar no vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Inserto de cultura de células de PTFE hidrofílico	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, PTFE hidrofílico, tamanho de poro de 0,4 μm
35 mm Pratos com fundo de vidro	MatTek	P35G-1.5-20-C Manga	20mm de diâmetro do vidro. Espessura do vidro da lamínula 1,5
LSM 510 Micoscópio Confocal	Zeiss	LSM 510	10x Objetiva de Ar (c-Apochromat NA 0,45)
PECON Stagetop Incubator	PeCON Alemanha	(Descontinuado)	Incubadora PM 2000 RBT é um produto comprável projetado para uso com microscópios Zeiss.