Imagem espontânea de cálcio para dinâmica específica do compartimento em astrócitos

Neste artigo

Resumo

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Fonte: Bannai, H., et. al., Dissecção de sinais locais de Ca2+ em células cultivadas por indicadores de Ca2+ direcionados à membrana. J. Vis. Exp. (2019)

O vídeo demonstra imagens de fluorescência para observar a dinâmica espontânea do cálcio específica do compartimento em astrócitos, monitorando sequencialmente proteínas sensíveis ao cálcio localizadas na membrana plasmática e no retículo endoplasmático.

Protocolo

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1. Imagem de Ca²⁺

Registrando atividades espontâneas de astrócitos que expressam Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f/
NOTA: Sem óptica de divisão de imagem, os sinais de Ca²⁺ na membrana plasmática e aqueles ao redor do retículo endoplasmático (RE) podem ser monitorados na mesma célula. Aqui, é descrito o registro sequencial de Lck-RCaMP2 (indicador de Ca²⁺ geneticamente codificado direcionado à membrana plasmática) e OER-GCaMP6f (indicador de Ca²⁺ geneticamente codificado direcionado à membrana do retículo endoplasmático externo) nos mesmos astrócitos. Uma objetiva de imersão em óleo com uma abertura numérica maior que 1,3 é altamente recomendada para atividade espontânea de Ca²⁺.
1. Ligue o microscópio, a câmera, a fonte de luz e a câmara de aquecimento do microscópio por pelo menos 30 minutos antes de gravar.
2. Montar a lamínula contendo as células transfectadas com Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f na câmara de registo e adicionar 400 μL do meio de imagem. Coloque uma tampa no topo da câmara.
3. Escolha o conjunto de filtros para GCaMP6f e a fonte de luz (luz de excitação azul, por exemplo, 470– 490 nm; consulte a Tabela de Materiais). Localize os astrócitos que expressam OER-GCaMP6f.
4. Escolha um conjunto de filtros e a fonte de luz para RCaMP2 (luz de excitação verde, por exemplo, 510–560 nm; consulte a Tabela de Materiais) e confirme se Lck-RCaMP2 é expresso nos mesmos astrócitos. Evite a exposição prolongada à fonte de luz para evitar o fotobranqueamento.
5. Grave imagens time-lapse de Lck-RCaMP2 a 2 Hz durante 2 min. Guarde os dados de imagem no HDD.
6. Altere o conjunto de filtros para GCaMP6f. Grave imagens de lapso de tempo de OER-GCaMP6f no mesmo campo de visão a 2 Hz por 2 min. Salve os dados no HDD.
7. Analise os dados usando o software de análise de imagem.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
18 mm de diâmetro lamínulas circulares	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Espessura 1, lamínulas circulares de 18 mm de diâmetro; lamínulas alternativas podem ser usadas.
Câmera para gravação			As seguintes câmeras estavam disponíveis para uso: câmera CCD refrigerada (por exemplo, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), câmera EM-CCD (por exemplo, Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) ou câmera CMOS (por exemplo, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
		de análise de imagem	Como Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH) e TI Workbench14 (feito sob medida)
Meio de imagem e buffer			Use o meio ou buffer ideal para o experimento. Quando o meio é usado, o meio sem vermelho de fenol é desejável para reduzir a fluorescência de fundo. Adicione HEPES 20 mM para manter o pH fora da incubadora de dióxido de carbono.
		fluorescência invertida	Como IX73 (Olympus) ou Eclipse TI (Nikon Instech)
Conjunto de filtros de microscópio para imagens			Filtro apropriado para GFP (excitação, 480 ± 10 nm; emissão, 530 ± 20 nm)
Conjunto de filtros de microscópio para imagens			Filtro apropriado para RFP (excitação, 535 ± 50 nm; emissão, passagem longa de 590 nm)
Sistema de aquecimento			Um sistema de aquecimento para manter as células a 37°C durante a imagem. Para evitar desvios causados pela expansão térmica, são recomendados sistemas de aquecimento que cubram todo o microscópio (por exemplo, Tokai Hit, Thermobox).
Fonte de luz do microscópio para excitação			Lâmpada de mercúrio (100 W), lâmpada de xenônio (75 W), sistema de iluminação de diodo emissor de luz (LED) (por exemplo, CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., fonte de LED de 4 comprimentos de onda; Lumencor, motor de luz SPECTRA X). No caso de caroço de mercúrio e lâmpada de xenônio, use o filtro ND para reduzir a intensidade da excitação.
A objetiva			de microscópio Plan-Apochromat oil immersion objective com abertura numérica superior a 1,3 é altamente recomendada para o registro da atividade espontânea de Ca²⁺ em neurônios e astrócitos.
Câmara de gravação	Elveflow	Ludin Chamber	Esta câmara de gravação é para lamínulas redondas de 18 mm de diâmetro.
Estereomicroscópio			Usado para dissecar hipocampos. Olympus SZ60 ou estereomicroscópios equivalentes estão disponíveis.

de imagens microscópicas Software Microscópio de GCaMP6f RCaMP2 do microscópio

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