Induzindo lesão do nervo fibular em um camundongo para estudar a regeneração da junção neuromuscular

Resumo

Fonte: Dalkin, W., et al. O método de lesão do nervo fibular: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que reparam as junções neuromusculares. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um procedimento cirúrgico para induzir lesão do nervo fibular em um camundongo para estudar a regeneração da junção neuromuscular (JNM). O procedimento envolve expor o nervo fibular, aplicar pressão controlada para induzir lesão e garantir que o epineuro permaneça intacto para apoiar a regeneração axonal. Com o tempo, os macrófagos eliminam os detritos axonais, facilitando o reparo do nervo e o restabelecimento das JNMs.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparando animais para cirurgia

1. Anestesie camundongos com uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) por meio de injeção inguinal subcutânea com uma seringa estéril de insulina de 1 ml. A solução transportadora contém uma mistura de solução salina a 0,9%, 17,4 mg/ml de cetamina e 2,6 mg/ml de xilazina. Coloque os animais de volta em gaiolas enquanto aguarda o efeito da medicação.
   NOTA: Se a dose de ataque não fornecer anestesia suficiente durante o procedimento, um adicional de 25% da dose de ataque pode ser injetado.
2. Monitore os animais após a injeção para verificar se há frequências respiratórias estáveis e depressão apropriada dos níveis de excitação. Verifique o nível de excitação com uma pitada do pé traseiro, que não deve provocar resposta quando suficientemente anestesiado.
   NOTA: Isso geralmente leva de 3 a 5 minutos para um camundongo adulto jovem com média de 25 a 30 g. Se o animal ainda responder após 10 minutos após a injeção, um adicional de 25% da dose de carga anestésica pode ser injetada.
3. Aplique vaselina e pomada oftálmica de óleo mineral leve nos olhos do animal para evitar o ressecamento. Remova os animais da gaiola e coloque-os em uma superfície limpa e plana. Raspe o membro posterior desejado do pé à pélvis usando um aparador de cabelo elétrico, expondo apenas o aspecto lateral do membro.
4. Aplique um removedor químico de pelos no local depilado por 1 min. Remova manualmente os pelos usando lenços umedecidos de laboratório. Limpe a área depilada com um lenço umedecido em etanol.

2. Procedimento cirúrgico

1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos em autoclave ou outro método apropriado. Limpe o local cirúrgico e a placa cirúrgica com etanol a 80% / H₂O. Desinfete o local cirúrgico com providona. Coloque o mouse na prancha cirúrgica e alinhe-o com as restrições dos membros. Mantenha o membro posterior alvo em uma posição anatomicamente natural com a articulação do joelho ligeiramente estendida sem rotação interna ou externa.
2. Coloque o animal e a prancha sob o microscópio cirúrgico. Oriente-se para o local adequado da incisão por meio da palpação de pontos de referência superficiais, especificamente a articulação óssea do joelho e a crista entre os músculos tibial anterior e gastrocnêmio.
3. Faça uma incisão de aproximadamente 3 cm através da pele usando um bisturi ou tesoura de mola enquanto usa uma pinça geral para preensão. Faça a incisão perpendicular ao curso subjacente do nervo fibular comum.
4. Continue a incisão através da fáscia superficial, expondo os músculos bíceps femoral e vasto lateral. Separe esses músculos cortando a fáscia profunda de conexão. Um corte de 1-2 cm deve ser suficiente.
5. Retrair o músculo bíceps femoral caudalmente usando afastadores mecânicos, revelando o nervo fibular comum.
6. Trace o nervo proximalmente até que sua interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio seja encontrada.
   Nota: A exposição pode exigir manipulação adicional da pele e do músculo retraídos. Esta interseção é usada como um marco estável para lesão nervosa.
7. Segure o nervo com uma pinça fina, alinhando as pontas de forma paralela à borda lateral do tendão gastrocnêmio. Esmague o nervo fibular comum aplicando pressão constante e forte por 5 segundos.
8. Corroborar o esmagamento total do nervo por inspeção visual através do escopo cirúrgico. Ele parecerá translúcido no local da lesão. Se estiver usando camundongos que expressam proteínas de fluorescência em axônios periféricos, a fluorescência desaparecerá do local da lesão.
9. Remova os afastadores e realinhe os músculos em suas posições anatômicas. Feche o local da incisão com suturas de seda 6-0. 1-3 suturas simples interrompidas são suficientes. Coloque o mouse em recuperação em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa.
10. Monitore todos os animais por 2 horas após a operação para verificar a respiração e quaisquer reações adversas à anestesia. Administre uma dose inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg por injeção inguinal subcutânea imediatamente após a recuperação da cirurgia. Dê 3 doses adicionais a cada 12 horas nas próximas 48 horas. Após a recuperação total, devolva os ratos à unidade de cuidados com os animais.

Materiais

< classe de figura='tabela'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários CetaminaVetOne501072 XylazineLloyd Inc.3437 BuprenorfinaZoopharm1Z-73000-150910 NairNair Kim-toalhetesKimtech34155 Barbeador ElétricoBraintree ScientificCLP-64800 80% EtOH/H₂O 10% Proviodo 1 ml de seringa de insulina Tesoura de molaVannas91500-09 No. 15 bisturiBraintree ScientificSSS 15 # 5 FórcepsDumont11252-00 6-0 sutura de seda na agulha de corte reversoSutura ExpressAlmofada de aquecimento de roedores 752B Braintree ScientificAP-R-18.5 Alexa 555 sondas moleculares alfa-BTX conjugadasB35451 VectashieldVector LabsH-1000 Microscópio de zoom estéreo Olympus562037192 Zeiss 700 Microscópio confocalZeiss Bomba de perfusão peristáltica de fluxo variávelFisher Scientific13-876-3