De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7-efetoras de memória T (TEM) linfócitos. Aqui demonstramos como ativar células antígeno-específicas TEM, induzir DTH adotivos em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.
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Artigo de método
Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos efetores CCR7-T de memória que infiltram o local da injeção de um antígeno contra o qual o sistema imunológico tem sido preparado. A reação inflamatória é caracterizada por vermelhidão e inchaço do local de desafio antigênico. É um modelo conveniente para determinar a eficácia in vivo de imunossupressores. DTH cutânea pode ser induzida ou por transferência adotiva de linfócitos T antígeno-específicos ou por imunização ativa com um antígeno e subseqüente desafio intradérmico com o antígeno para induzir a reação inflamatória da pele em uma área determinada. Respostas DTH pode ser induzida a vários antígenos, para a ovalbumina exemplo, a tuberculina, toxóide tetânico, ou hemocianina limpet buraco da fechadura. Tais reações também pode ser induzida contra autoantígeno, por exemplo, para proteína básica da mielina (MBP) em ratos com encefalomielite auto-imune experimental induzida com MBP, um modelo animal para a esclerose múltipla (1). Aqui demonstramos como para induzir uma reação adotivos DTH em ratos Lewis. Vamos primeiro estimulam as células T específicas ovalbumina in vitro e injetar essas células ativadas por via intraperitoneal em ratos ingênuos. Depois de permitir que as células para equilibrar in vivo por 2 dias, vamos desafiar os ratos com ovalbumina no pavilhão auricular de uma orelha, enquanto a outra orelha wil receber solução salina. A reação inflamatória será visível 3-72 horas depois e espessura de ouvido será medido como uma indicação da gravidade da DTH.
Protocolo
1. Estimulação dos linfócitos T específicos ovalbumina
Descansando células ovalbumina específico T são estimuladas com ovalbumina na presença de ratos irradiados timócitos Lewis (30 Gy) como células apresentadoras de antígenos (APCs), no Médio Estimulação (Prepare em DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitaminas + + 2ME Rat Serum + ovalbumina, nas concentrações finais observou na lista de materiais.)
Preparação do soro de ratos
- Tomamos soro dos ratos nos sacrificamos como doadores timo.
- Os ratos são profundamente anestesiado por inalação de halotano e tanto sangue quanto possível é dese....
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Discussão
O desafio antigênico também pode ser realizada em outros locais, por exemplo, na pele do dorso (2). Nós, no entanto descobrir que um desafio. Usando o pavilhão da orelha, como mostra este vídeo, permite a medição mais precisa da reação DTH.
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Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Alexander Flugel (Martinsried, Alemanha) para fornecer-nos com a GFP-rotulados, linha de células T específicas ovalbumina utilizado neste protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, no Meio de Estimulação |
| Penicilina – Estreptomicina – L-Glutamina | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectivamente, final, no Meio de Estimulação |
| Aminoácidos não essenciais | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, no Meio de Estimulação |
| Vitaminas RPMI | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, no Meio de Estimulação |
| beta-mercapto–etanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, no Meio de Estimulação |
| Soro de rato síngeo | 1% final. Veja explicação no Protocolo. | ||
| Ovalbumina | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, no Meio de Estimulação. |
Referências
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G.
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Reimpressões e permissões
