Desenvolvendo uma rede neural de engenharia de microtecidos usando uma microcoluna baseada em hidrogel

Resumo

Fonte: Struzyna, L. A. et. al., Redes Neurais de Engenharia de Microtecidos Tridimensionais Anatomicamente Inspiradas para Reconstrução, Modulação e Modelagem do Sistema Nervoso. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de redes neurais de microengenharia de tecidos usando uma microcoluna de hidrogel com um núcleo de matriz extracelular. Agregados neuronais semeados aderem, estendem projeções e formam redes neurais estruturadas, contribuindo para avanços no neurodesenvolvimento e na pesquisa neuroterapêutica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Desenvolvimento do Hidrogel de Agarose (Componente Acelular de redes neurais de engenharia de microtecidos (micro-TENNs)))Preparação

da

1. solução de agarose
   1. Dentro de um gabinete de biossegurança, prepare reservatórios para as micro-colunas transferindo 20 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) para cada uma das duas placas de Petri de 10 cm. Esterilize pinças finas e microbisturis com um esterilizador de esferas quentes.
   2. Pesar 3 g de agarose e transferi-los para um copo estéril dentro da cabine de biossegurança. Adicione 100 mL de DPBS para uma concentração final de 3% peso/volume (p/v). Inclua uma barra magnética limpa e cubra o copo com papel alumínio.
   3. Com uma placa quente/agitador, aquecer o copo a 100 °C e agitar a 120-200 rpm para dissolver completamente a agarose (a solução passará de turva para límpida). Mantenha o aquecimento e a agitação depois para evitar a gelificação e altere a temperatura de aquecimento conforme necessário para evitar a queima da agarose.
      NOTA: A fabricação com o dispositivo de corte a laser e os tubos capilares é apresentada abaixo nas subseções 1.2 e 1.3, respectivamente. Prossiga para a subseção 1.4 depois de concluir as etapas descritas em qualquer subseção. Para ambos os métodos de fabricação de microcolunas, adicione a agarose líquida rapidamente, pois a agarose solidifica rapidamente à medida que esfria. Ao esterilizar com uma autoclave em qualquer uma das etapas a seguir, use as condições padrão aplicadas aos artigos de vidro.
2. Preparação de microcoluna usando um dispositivo de corte a laser
   NOTA: O dispositivo de corte a laser é cortado de acrílico transparente usando um cortador a laser CO₂ comercial. A fabricação de estruturas e dispositivos por meio de corte a laser está bem documentada para uma variedade de aplicações de engenharia e pesquisa. Este molde (Figura 1) consiste em uma matriz de cinco canais cilíndricos, cada um com um diâmetro de 398 μm e um comprimento de 6,35 mm. Essas matrizes cilíndricas são formadas ao longo de seu comprimento por duas peças: uma metade inferior (comprimento: 25,4 mm, largura: 6,35 mm, altura: 6,0 mm) e uma metade superior (comprimento: 31,5 mm, largura: 6,35 mm, altura: 12,7 mm), conforme mostrado nas Figuras 1A e 1B, respectivamente. As duas metades podem ser presas juntas pelas tampas anterior e posterior observadas na Figura 1C (comprimento: 31,5 mm, largura: 6,35 mm, altura: 12,7 mm), que apresentam quatro orifícios de alinhamento que coincidem com dois orifícios cada nas peças superior e inferior e que ajudam a prender todas as peças juntas quando aparafusadas. Essas tampas também incluem cinco orifícios, concêntricos aos canais cilíndricos, nos quais as agulhas de acupuntura podem ser inseridas para formar o lúmen das microcolunas.
   1. Esterilize o dispositivo mostrado na Figura 1 cobrindo-o com papel alumínio e autoclavando. Monte o dispositivo conforme mostrado na Figura 1D alinhando as tampas anterior e posterior apenas com a metade inferior e prendendo as três partes com dois parafusos e porcas #4-40 (diâmetro da rosca: 3.05 mm) nos orifícios de alinhamento inferior.
   2. Introduza totalmente uma agulha de acupuntura (diâmetro: 180 μm, comprimento: 30 mm) nos orifícios da agulha na tampa anterior ou posterior do dispositivo (Figura 1D). Com uma micropipeta, despeje agarose líquida suficiente (~ 1 mL para os cinco canais) na metade inferior para preencher completamente cada uma das metades do canal cilíndrico.
   3. Coloque imediatamente a metade superior do dispositivo sobre a metade inferior e aplique pressão até que esteja firmemente no lugar para completar os canais cilíndricos (o atrito entre as tampas e a parte superior manterá a última no lugar). Aguarde ~5 min em temperatura ambiente após a adição de agarose para permitir sua gelificação dentro dos canais do dispositivo.
   4. Extraia manualmente a agulha de cada um dos orifícios nas tampas do dispositivo. Remova os parafusos e separe manualmente as duas tampas e a metade superior da metade inferior, onde esta segurará as microcolunas de hidrogel.
   5. Use uma pinça fina para remover suavemente as microcolunas dos canais na metade inferior e coloque-as na placa de Petri previamente preparada contendo DPBS (etapa 1.1.1). Reutilize o dispositivo para outra rodada de fabricação de microcolunas. Prossiga para a subseção 1.4.
3. Fabricação de microcolunas usando tubos capilares
   1. Transfira tubos capilares de vidro (diâmetro: 398,78 μm, comprimento: 32 mm) para o interior do gabinete de biossegurança. Quebre manualmente os tubos longos em fragmentos de 2,0 a 2,5 cm e insira totalmente uma agulha de acupuntura (diâmetro: 180 μm, comprimento: 30 mm) em cada fragmento (Figura 2A).
   2. Transferir 1 ml de agarose líquida do copo para a superfície de uma placa de Petri vazia. Segurando o tubo capilar e a agulha introduzida, coloque uma extremidade do tubo em contato com a piscina de agarose líquida para preenchê-la por ação capilar. Agite o tubo para promover a elevação capilar.
      NOTA: Encha os tubos capilares com agarose líquida até que a ação capilar permitir; Posteriormente, essas microcolunas podem ser cortadas em construções menores, dependendo do comprimento desejado. A piscina de agarose de 1 mL é normalmente usada para apenas um tubo, pois a agarose esfria e gelifica rapidamente, evitando mais ação capilar.
   3. Quando o líquido parar de subir, remova o tubo capilar da piscina e coloque-o horizontalmente na superfície de uma placa de Petri. Aguarde 5 minutos para que o gel de agarose assente dentro dos tubos.
   4. Posicione o polegar e o indicador em ambos os lados do tubo e pressione contra ele. Use a outra mão para puxar rapidamente a agulha enquanto usa o polegar e o indicador para evitar que a própria microcoluna deslize para fora do tubo. Insira uma agulha de calibre 30 no tubo capilar para empurrar lentamente a microcoluna para fora em um prato contendo DPBS (etapa 1.1.1).
4. Corte e esterilização de micro-colunas
   1. Transfira delicadamente uma micro-coluna de DPBS para um prato vazio usando uma pinça fina. Adicione 10 μL de DBPS ao topo da microcoluna com uma micropipeta para evitar o ressecamento. Coloque o último prato abaixo de um estereoscópio para orientação visual.
      NOTA: Ao longo do protocolo, a secagem ou desidratação da microcoluna refere-se à aquisição de uma estrutura amassada que é visualmente distinguível da aparência típica e hidratada dessas construções. As microcolunas desidratadas se fixam firmemente à superfície das placas de Petri e não podem ser movidas facilmente, enquanto as construções hidratadas tendem a deslizar pela superfície após serem manipuladas com fórceps. Uma imagem de contraste de fase de uma microcoluna completamente seca é mostrada na Figura 3A.
   2. Apare a microcoluna com um microbisturi para encurtá-la para o comprimento desejado (aqui, 2-5 mm). Transportar a microcoluna aparada com pinças finas para a outra placa de Petri DPBS preparada no passo 1.1.1.
   3. Repita as etapas 1.4.1 e 1.4.2 para cada microcoluna fabricada.
   4. Esterilizar as microcolunas nas placas de Petri contendo DPBS sob luz ultravioleta (UV) durante 1 h. Armazenar as placas de Petri a 4 °C antes da adição da matriz extracelular (MEC) e do revestimento celular.

2. Cultura de Neurônios Primários e Método de Agregação Celular

1. Forçada Preparação da matriz de micropoços piramidais
   NOTA: Esta seção emprega um molde impresso em 3D que consiste em uma base cilíndrica (diâmetro: 2,2 cm, altura: 7,0 mm) e nove pirâmides quadradas na parte superior (comprimento lateral: 4,0 mm, ângulo inclinado: 60°), organizadas em uma matriz 3 x 3, conforme mostrado na Figura 1E. O processo de manufatura aditiva usando impressoras 3D disponíveis comercialmente está bem documentado. O software de design auxiliado por computador pode ser usado para projetar o molde. O arquivo de design resultante pode então ser convertido digitalmente em um caminho de ferramenta para uma impressora 3D. Cada impressora tem especificações diferentes e as instruções para configurar e operar uma impressora 3D variam de acordo.
   1. Use uma broca de 3/32" para fazer 16 furos em uma matriz 4 x 4 (comprimento lateral: 4 cm, separação de furos: 1 cm), centralizado na tampa de uma placa de Petri de 10 cm. Dentro de uma capela de exaustão química, use a parte inferior da placa de Petri para pesar 27 g de polidimetilsiloxano (PDMS) e 3 g de agente de cura (para uma proporção de 1:10). Mexa com uma microespátula para distribuir o agente uniformemente.
   2. Cubra o PDMS/agente de cura com a tampa perfurada. Conecte uma extremidade de uma mangueira à porta de vácuo da hotte e insira a outra extremidade na haste de um funil (diâmetro da boca: 10 cm, comprimento da haste: 3 cm, diâmetro da haste: 1,5 cm).
   3. Faça uma abertura com uma broca de 3/32" na parte superior de um bulbo de pipeta de 1 mL e insira e prenda uma ponta de micropipeta de 1.000 μL na abertura (com a extremidade pontiaguda para cima). Coloque o bulbo e a ponta na mangueira e puxe a mangueira para cima até que o bulbo vede a mangueira na haste do funil.
   4. Coloque o funil na tampa do prato furado e prenda a mangueira com um suporte resistente disponível. Abra a válvula de vácuo por 5 min para sucção e traga as bolhas de ar para a superfície.
   5. Feche a válvula, remova o funil e bata a placa de Petri contra a superfície da hotte ~3 vezes para estourar quaisquer bolhas de ar restantes.
   6. Coloque um molde impresso em 3D de poço piramidal em cada um dos poços em uma placa de cultura de 12 poços, com as pirâmides apontando para cima. Despeje o PDMS/agente de cura em cima dos moldes até que cada poço da placa esteja cheio. Cubra a placa de 12 poços com a tampa e leve ao forno por 1 hora a 60 °C para secar.
   7. Remova cuidadosamente cada matriz de micropoços PDMS (Figura 1F) da placa com uma microespátula. Cubra as matrizes PDMS com papel alumínio e esterilize-as em autoclavagem. Dentro de um gabinete de biossegurança, insira uma matriz de micropoços em cada poço de uma placa de 12 poços (Figura 2B).
2. Isolamento de neurônios corticais de fetos de ratos
   1. Adicione ~20 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) a cada uma das quatro a seis placas de Petri de 10 cm (uma para cada tecido dissecado) dentro de um gabinete de biossegurança. Transfira esses pratos para uma coifa e coloque-os no gelo. Esterilize os instrumentos de dissecação, como microbisturis, tesouras e pinças, com um esterilizador de esferas quentes.
   2. Meio basal de neurônio embrionário pré-aquecido + suplemento sem soro a 2% + L-glutamina 0,4 mM (doravante denominado "meio de cultura") e tripsina 0,25% + ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM a 37 °C. Desoxirribonuclease (DNase) I colocando-a à temperatura ambiente. Preparar 1,5 ml de uma solução de DNAse I a 0,15 mg/ml em HBSS e manter a solução em gelo.
   3. Eutanasiar um rato embrionário grávida no dia 18 por inalação de dióxido de carbono e confirmar a morte por decapitação. Transfira a carcaça para uma capa de dissecção estéril e coloque-a com o lado ventral voltado para cima. Enxágue bem o abdômen com etanol a 70%.
   4. Abra o útero e remova os fetos (geralmente ~ 11) dos sacos amnióticos com uma tesoura e transfira-os com uma pinça para uma placa de Petri contendo HBSS frio, conforme descrito. Colocar um bloco de granito refrigerado (-20 °C) por baixo do estereoscópio. Coloque a placa de Petri na superfície deste bloco frio para conservar a baixa temperatura do HBSS durante todo o procedimento de dissecação.
   5. Enxágue os filhotes agitando o HBSS e transfira-os para o próximo prato limpo contendo HBSS. Com o auxílio do estereoscópio e dos instrumentos de dissecação, remova sequencialmente as cabeças, hemisférios cerebrais e córtices dos fetos e transfira cada tecido com fórceps para uma nova placa cheia de HBSS após cada dissecção.
   6. Aspire apenas os córtices com uma pipeta Pasteur e coloque o tecido em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Descarte os outros tecidos dissecados. Enxágue os córtices três vezes adicionando e removendo sequencialmente ~ 5 mL de HBSS com uma pipeta sorológica. Coloque o tubo no gelo quando não estiver em uso.
   7. Transfira os córtices com uma pipeta Pasteur para um tubo de 15 mL contendo tripsina-EDTA pré-aquecido (4-6 córtices por 5 mL de tripsina-EDTA). Agite manualmente o tubo uma vez e coloque-o a 37 °C. Inverta o tubo a cada 3 minutos para evitar que o tecido se aglomere.
   8. Pare a exposição à tripsina após ~ 10 min removendo o tecido com uma pipeta Pasteur e transferindo-o para um tubo de centrífuga limpo de 15 mL. Adicione a solução de DNase I 0,15 mg/ml (1,5 ml) ao tubo com uma pipeta.
   9. Use uma pipeta Pasteur para quebrar manualmente os aglomerados de tecido e, em seguida, vórtice (~ 30 s) até que a solução pareça homogênea e não haja fragmentos de tecido restantes no líquido. Se não for possível homogeneizar completamente a solução, extraia os fragmentos insolúveis puxando-os para a ponta de uma pipeta Pasteur.
   10. Centrifugar a solução celular homogénea obtida no passo 2.2.9 a 200 x g durante 3 min. Retirar o sobrenadante com uma pipeta de Pasteur, tendo o cuidado de não perturbar as células peletizadas. Adicione 2 mL de meio de cultura com uma pipeta sorológica e vórtice para ressuspender as células.
   11. Conte o número de células na solução preparada na etapa 2.2.10 usando um hemocitômetro; o rendimento esperado é de 3,0-5,0 x 10⁶ células/hemisfério cortical. Prepare 1 mL ou mais de suspensão celular em meio de cultura, com densidade de 1,0-2,0 x 10⁶ células / mL.
3. Formação de agregados de células neuronais
   1. Com uma micropipeta, adicione 12 μL da suspensão de células de 1,0-2,0 x 10⁶/mL em cada micro-poço da matriz PDMS (que foi colocada na placa na etapa 2.1.7).
      NOTA: A concentração de células pode ser ajustada dependendo do diâmetro interno da microcoluna e do tamanho desejado do agregado celular, pois concentrações mais altas produzem agregados maiores.
   2. Centrifugue a placa a 200 x g por 5 min para forçar a agregação de células no fundo dos micropoços (Figura 2B). Adicione cuidadosamente ~ 2 mL de meio de cultura ao topo de cada matriz PDMS para cobrir todos os micro-poços semeados, tomando cuidado para não perturbar as células agregadas.
   3. Incubar a placa durante 12-24 h a 37 °C e 5% de CO₂.

3. Desenvolvimento do componente celular da fabricação do núcleo de ECM de micro-TENNs

1. 1. Após a incubação agregada, adicione colágeno tipo I e laminina ao meio de cultura (para uma concentração de 1 mg/mL cada) em um tubo de microcentrífuga para preparar a solução de ECM. Execute as etapas 3.1.2-3.1.4 em temperatura ambiente, mas mantenha o tubo com ECM no gelo quando não estiver em uso para evitar gelificação prematura.
      NOTA: O gasto típico é de 4 μL de solução de ECM para cada microcoluna (comprimento: 5 mm, ID: 180 μm).
   2. Ajuste o pH da solução de MEC transferindo 1-2 μL para papel de tornassol para verificar o pH inicial, adicionando 1 μL de hidróxido de sódio (NaOH) 1 N e/ou ácido clorídrico (HCl) 1 N ao ECM, conforme necessário, e repetindo até que o pH seja 7,2-7,4. Garanta a homogeneização da solução de ECM pipetando para cima e para baixo, evitando a formação de bolhas de ar.
   3. Transfira as microcolunas com pinças esterilizadas das placas na etapa 1.4.3 para placas de Petri vazias de 35 ou 60 mm. Trabalhe em 4-5 micro-colunas de cada vez para evitar a desidratação. Conecte uma ponteira de 10 μL a uma ponteira de 1.000 μL a uma micropipeta. Usando o estereoscópio para orientação visual, coloque a ponta em uma extremidade das microcolunas e aspire para extrair DPBS residual e bolhas de ar do lúmen.
   4. Extraia rapidamente 4-5 μL de ECM em uma micropipeta. Observando sob um estereoscópio, coloque a ponta da micropipeta em uma das extremidades das microcolunas e descarregue ECM suficiente para preencher o lúmen. Confirme a ausência de bolhas de ar no lúmen, pois elas podem inibir o crescimento axonal através da MEC. Se houver bolhas de ar, remova o ECM, conforme explicado na etapa 3.1.3, e adicione o ECM novamente.
   5. Para evitar a desidratação, adicione ~ 2 μL de ECM ao redor de cada microcoluna. Incubar as microcolunas de hidrogel/ECM nas placas de Petri a 37 °C e 5% de CO₂ durante 25 min. Prossiga para a semeadura celular imediatamente após a incubação.
      NOTA: O período de incubação na etapa 3.1.5 destina-se a dar tempo para a polimerização do colágeno e da laminina dentro das microcolunas.
2. Semeadura de células neuronais nas micro-colunas
   NOTA: Para alterar o meio de cultura dos agregados transduzidos, incline a placa, use uma micropipeta para remover o meio que se acumula na parede do poço e, em seguida, adicione lentamente ~ 1 mL contra a parede (para evitar perturbar os agregados nos micro-poços piramidais). Repita essa mudança de meio uma segunda vez.
   1. Após o período de incubação na etapa 3.1.5, transfira aproximadamente 10-20 μL de meio de cultura para duas áreas livres nas placas de Petri que contêm as microcolunas. Use uma micropipeta para transferir individualmente os agregados para a placa de Petri que contém as construções e mova-os com uma pinça para um dos pequenos pools de meio de cultura para preservar a saúde celular.
   2. Enquanto observa sob um estereoscópio, insira um agregado em cada extremidade das micro-colunas para micro-TENNs bidirecionais ou em uma extremidade para uma arquitetura unidirecional (conforme desejado) usando uma pinça. Confirmar a colocação dos agregados no interior das microcolunas utilizando o estereoscópio. Use uma pinça para mover as microcolunas semeadas para o outro pequeno pool de meio de cultura para evitar a desidratação e preservar a saúde do agregado.
   3. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 45 min para permitir que os agregados adiram ao ECM. Verificar se os agregados permanecem nas extremidades das microcolunas utilizando o estereoscópio; Reintroduzir os agregados celulares e repetir a etapa de incubação conforme necessário.
   4. Inundar cuidadosamente as placas de Petri que contêm os micro-TENNs com meio de cultura (3 ou 6 ml para uma placa de Petri de 35 ou 60 mm, respectivamente) com uma pipeta serológica. Coloque os pratos em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ para cultura de longo prazo.
   5. Realize trocas de meio de meio a cada 2 dias com meio de cultura. Remova cuidadosamente metade do meio antigo com uma pipeta e use o estereoscópio para orientação visual para evitar a sucção dos micro-TENNs. Substitua por uma pipeta adicionando lentamente meio fresco e pré-aquecido.

Resultados

Figura 1: Plantas do dispositivo de fabricação de microcolunas cortadas a laser e do molde de micropoços piramidal impresso em 3D para agregação celular. (A)-(B) Planta e imagem das metades inferior e superior da matriz de canais cilíndricos, respectivame...

Materiais

< >< table class='ck-table-resized'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários Laser cutterUniversal laser systemsPLS4.75Usado para fabricar o molde de microcanal cortado a laser.Dispositivo de fabricação de micro-coluna cortado a laserFeito sob medida--------------Entre em contato com nosso grupo de pesquisa se estiver interessado. Dimensões e plantas fornecidas no manuscrito.Parafusos----------------------------#4-40 com um diâmetro de rosca de 3,05 mmPorcas----------------------------#4-40 com um diâmetro de rosca de 3,05 mmAgulha de acupunctura (180 μm de diâmetro)Lhasa medicalsj.16X40O diâmetro pode ser variado de acordo com o tamanho desejado para o lúmen da micro-coluna.Placa de PetriFisher08772B Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)Pipeta sorológica descartável de poliestireno 14200075 Invitrogen Fisher13-678-11D AgaroseSigmaA9539-50G Tubo capilar (398 μm de diâmetro)Fisher21170DO diâmetro pode variar de acordo com o tamanho desejado para o invólucro da microcoluna.Placa quenteFisherSP88857200 barra magnéticaFisher1451352 MicropipetaSigmaZ683884-1EA agulha de calibre de 25 mmFisher14-826-49 MicrobisturiRoboz cirúrgicoRS-6270 Tesoura Ferramentas de ciências finas14081-09 FórcepsInstrumentos de precisão mundiais501985 Esterilizador de esferas quentesSigmaZ378550-1EA EstereoscópioNikonSMZ800NUsado para todas as etapas de dissecação e para fabricação de micro-TENN.Cauda de rato colágeno tipo ICorning354236Manter a 4 ºC e remover somente quando necessário. Use gelo para preservar sua temperatura quando estiver em uso.Tubo de microcentrífugaFisher02-681-256 Laminina de ratoCorning354232Manter a 4 ºC e retirar apenas quando necessário. Use gelo para preservar sua temperatura quando estiver em uso.Meio neurobasalInvitrogen21103049meio basal para a cultura de células neuronais pré-natais e embrionárias. Conservar a 4ºC e aquecer a 37 ºC antes de utilizar.Hidróxido de sódio (NaOH)FisherSS2661 Ácido clorídrico (HCl)FisherSA48-1 Papel de tornassolFisher09-876-18 Solução salina balanceada de Hank (HBSS)Invitrogen14170112Armazenar a 4 ºC.0,25% de tripsina-EDTAInvitrogen25200056Armazenar a -20 ºC e aquecer a 37 ºC antes de usar.Desoxirribonuclease pancreática bovina (DNase) ISigma10104159001Armazenar a -20 ºC e aquecer a 37 ºC antes de usar.Suplemento B-27Invitrogen12587010Suplemento adicionado ao meio neurobasal para a cultura de neurônios hipocampais e corticais. Conservar a -20 ºC e aquecer a 37 ºC antes de utilizar.L-glutaminaInvitrogen35050061Conservar a -20 ºC e aquecer a 37 ºC antes de utilizar.Sprague Dawley dia embrionário 18 ratosCharles RiverStrain 001 Pipeta PasteurFisher22-042816 Tubo de centrífuga de 15 mLEMESCO1194-352099 VortexFisher02-215-414 CentrífugaFisher05-413-115 HemocitômetroImpressora 3D Fisher02-671-6 Objet30Stratasys--------------Usada para fabricar os moldes de micro-poços piramidais.Molde de poço piramidal impresso em 3DFeito sob medida-------------- entre em contato com nosso grupo de pesquisa se estiver interessado. Dimensões e plantas fornecidas no manuscrito.Polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de curaFisherNC9285739Vem como kit com elastômero e agente de cura. Use dentro de uma capela de exaustão química.FunilFisher10-348C 1 ml bulbo de pipetaSigmaZ509035 Micro-espátulaFisherS50821 Placa de cultura de 12 poçosEMESCO1194-353043 FornoFisher11-475-154 IncubadoraFisher13 998 076 Microscópio Eclipse Ti-SNikon -------------- Usado para tirar as imagens de contraste de fase. Com aquisição de imagem digital usando uma câmera QiClick em interface com o software de pesquisa básica Nikon Elements (4.10.01).